骨髓间充质干细胞联合内皮祖细胞构建血管网络化组织工程化心肌

发布时间：2017-09-13 13:22

  本文关键词：骨髓间充质干细胞联合内皮祖细胞构建血管网络化组织工程化心肌

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【摘要】：目的:分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)和内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs),应用BMSCs联合不同比例EPCs与脱细胞牛心包体外构建具有血管网络化的工程化心肌样组织,并将联合构建的各组工程化心肌样组织植入裸鼠体内,检测微血管网络的形成。论证联合应用大鼠BMSCs和EPCs体外构建具有血管化网络的工程化心肌样组织的可行性,及植入体内后生成的新生血管网络功能的有效性,并探讨BMSCs/EPCs联合应用的促进血管网络化形成的最佳比例。方法:第一部分:分离、培养BMSCs,经流式对其进行鉴定。应用Ang II将BMSCs向心肌细胞定向诱导分化,对照组未添加诱导剂,采用MTT法检测各组细胞增殖曲线,并通过与对照组的对比计算不同浓度诱导组的细胞增殖抑制率。采用免疫荧光法检测各诱导组及对照组第1、4周心肌特异蛋白c Tn T、β-MHC的表达,并计算细胞转化率。RT-PCR检测不同浓度Ang II诱导组细胞培养4周时表达心肌早期转录因子GATA-4、Nkx2-5的情况。第二部分:分离、培养EPCs,通过免疫荧光法检测细胞表型v WF、FLK-1、CD34、CD133的表达,鉴定所获细胞为EPCs。用去污剂-酶消化法对新鲜牛心包进行脱细胞处理,并通过HE染色、SEM对其脱细胞前后的形态学及表面情况变化进行观察,计算脱细胞效率。将Ang II诱导培养4周的BMSCs,联合第1代EPCs与脱细胞牛心包生物支架材料进行体外复合培养,HE染色、SEM观察细胞在脱细胞牛心包上的形态及黏附生长情况。然后将体外构建的细胞/支架材料移植于裸鼠背部皮袋内,术后1、4周手术寻回植体,行HE染色、免疫组织化学染色及RT-PCR对微血管及心肌特异蛋白、基因进行检测,并观察构建的工程化心肌内部血管网络组织形成情况。结果:第一部分:原代培养的BMSCs 5~6天细胞开始成簇生长,形态为长梭形及多角形,呈旋涡状排列。12~14天细胞长成单层。流式检测细胞CD29表达阳性,CD45表达阴性。Ang II各诱导组间的细胞增殖曲线相似,0.05μmol/L组细胞增殖抑制率于第5天出现负值,与其他组有显著性意义(P0.05)。第5,7天0.1μmol/L组细胞增殖抑制率明显低于0.2,0.5μmol/L组(P0.05)。各诱导组的BMSCs均可表达c Tn T、β-MHC。诱导1周,0.5μmol/L组c Tn T、β-MHC蛋白阳性表达率明显高于0.05μmol/L组(P0.05)。诱导4周,0.1μmol/L组与0.2μmol/L组两种蛋白阳性表达率均相似(P0.05)。对照组于1,4周表达均为阴性。诱导4周,经RT-PCR检测各诱导组BMSCs均可表达转录因子GATA-4、Nkx2.5,对照组表达阴性。第二部分:原代EPCs培养至7天左右逐渐出现贴壁细胞,第18天细胞融合可达80%,传代后子代细胞单层生长,铺路石样排列,增殖力旺盛。第1代细胞经免疫荧光化学染色检测v WF、FLK-1及CD34、CD133均为阳性。新鲜的牛心包经去污剂-酶联合四步法脱细胞处理和交联剂京尼平溶液固定后,HE染色观察脱细胞处理的效率接近100%。SEM检测其超微结构:脱细胞处理后的牛心包表明无细胞残留且表面排列杂乱,放大后可见有2μm小孔。新鲜牛心包表明覆盖有排列致密的细胞层。三组细胞在处理后牛心包支架材料上培养,随着培养时间的延长,细胞数量逐步增加,经SEM观察发现三组细胞在材料上黏附良好。将细胞/支架材料植入裸鼠后,伤口无红肿、渗液,于第一周时I期愈合。1周各植入组植入物取回后发现大小无明显变化,呈深蓝色,质地略硬,未见明显包膜。HE染色结果示:术后4周,各组植入物取回后颜色深蓝色,各组植入物表面有明显血管长入,且支架材料的周边润滑圆顿。BMSCs/EPCs组支架材料血管长入较BMSCs组及EPCs组明显,且周围血管丰富;BMSCs/EPCs的比例对血管的生成有一定影响,最佳比例为80:20。结论:(1)体外可以经大鼠骨髓分离、培养获得BMSCs和EPCs。(2)经AngⅡ诱导的BMSCs表达心肌特异蛋白c Tn T、β-MHC及转录因子GATA-4、Nkx2.5,且诱导分化适宜浓度为0.1μmol/L。(3)去污剂-酶联合四步法脱细胞处理牛心包,去细胞率可达100%,BMSCs/EPCs可与其良好粘附,可以成为构建工程化心肌的良好支架。(4)BMSCs/EPCs是构建心肌/血管组织工程的种子细胞,可在大鼠体内形成组织工程化心肌,并且可以促进工程化心肌新生血管网络的形成。证实了构建的混合细胞/脱细胞牛心包是一种良好的工程化心肌组织材料。
【关键词】：心肌组织工程 骨髓间充质干细胞 内皮祖细胞 脱细胞牛心包 血管化
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R318.08;R54
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 常用缩写词中英文对照表13-14
• 前言14-18
• 第一部分 不同浓度血管紧张素Ⅱ诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的定向分化的影响18-35
• 1 材料与方法18-25
• 1.1 实验动物18
• 1.2 主要试剂和仪器18-19
• 1.3 实验器材19
• 1.4 BMSCs 体外分离及培养19-20
• 1.5 BMSCS特征性表型鉴定20
• 1.6 免疫荧光检测骨髓间充质干细胞诱导后的特异蛋白表达20-21
• 1.7 检测大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导后抑制率21-22
• 1.8 PCR鉴定相关蛋白MRNA表达22-25
• 2 结果25-31
• 2.1 细胞形态学变化25-27
• 2.2 BMSCS特征性表型鉴定27
• 2.3 免疫荧光检测骨髓间充质干细胞诱导后的特异蛋白的表达27-29
• 2.4 大鼠骨髓间充质干细胞诱导后增殖能力及抑制率29-30
• 2.5 PCR鉴定相关蛋白MRNA表达30-31
• 3 讨论31-34
• 4 结论34-35
• 第二部分：基于BMSCS/EPCS体外构建具有血管化网络的组织工程化心肌35-61
• 1 材料与方法35-43
• 1.1 实验动物35
• 1.2 主要试剂和仪器35-36
• 1.3 EPCS体外分离及培养36-37
• 1.4 大鼠EPCS表面标记的检测37
• 1.5 新型脱细胞牛心包生物支架材料的制备37-38
• 1.6 对处理后的脱细胞牛心包进行消毒38
• 1.7 对脱细胞牛心包组织学观察38-39
• 1.8 大鼠BMSCS/EPCS联合培养复合脱细胞牛心包支架材料体外构建组织工程化心肌的实验研究39
• 1.9 观察各组细胞在支架上的生长情况39
• 1.10 大鼠BMSCS/EPCS联合培养复合京尼平交联的脱细胞牛心包支架材料异位构建血管网络化组织工程化心肌的实验研究39-41
• 1.11 对构建最佳比例血管网络化组织工程化心肌的研究检测41-43
• 2 结果43-56
• 2.1 形态学变化43-44
• 2.2 免疫荧光染色鉴定EPCS相关蛋白的表达44-45
• 2.3 牛心包脱细胞的处理过程及形态学变化45-48
• 2.4 大鼠BMSCS/EPCS联合培养复合脱细胞牛心包支架材料体外构建组织工程化心肌的实验观察48-50
• 2.5 大鼠BMSCS/EPCS联合培养复合京尼平交联的脱细胞牛心包支架材料异位构建血管网络化组织工程化心肌的实验研究50-54
• 2.6 对构建最佳比例血管网络化组织工程化心肌的研究检测54-56
• 3 讨论56-60
• 4 结论60-61
• 参考文献61-67
• 综述67-78
• 参考文献75-78
• 致谢78-79
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果79-80
• 个人简历80

【参考文献】

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本文编号：843942