FAKsiRNA通过下调mTERF1、CyclinD1抑制低氧诱导下人肺动脉平滑肌细胞增殖机制的研究

发布时间：2017-09-19 05:16

  本文关键词：FAKsiRNA通过下调mTERF1、CyclinD1抑制低氧诱导下人肺动脉平滑肌细胞增殖机制的研究

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【摘要】：目的:讨论低氧诱导下,FAK能否由m TERF1、Cyclin D1信号通路抑制人肺动脉平滑肌细胞增殖。方法:将人肺动脉平滑肌细胞进行原代,利用人工设计、化学合成的人FAK、m TERF1的si RNA脂质体经Lipofectamine2000将转入人肺动脉平滑肌细胞中。将细胞分为常氧(37℃,5%CO2,21%O2)NCsi RNA组、FAKsi RNA组、m TERF1si RNA组,低氧(37℃、5%CO2、5%O2、90%N2)NCsi RNA组、FAKsi RNA组、m TERF1si RNA组。用Realtime-PCR检测细胞内FAKm RNA、m TERF1m RNA、Cyclin D1m RNA的水平,Western Blot和FAK、Cyclin D1、m TERF1蛋白质的表达,免疫荧光检测FAK、Cyclin D1蛋白的表达,CCK8法测定细胞增殖能力。结果:与常氧NCsi RNA组比较,常氧FAKsi RNA组FAKm RNA及蛋白质表达明显减少(P0.05),而m TERF1、Cyclin D1m RNA及蛋白表达无明显差异(P0.05);与低氧NCsi RNA组比较,低氧FAKsi RNA组FAKm RNA及蛋白质表达明显减少(P0.05),而m TERF1 m RNA和m TERF1蛋白质、Cyclin D1m RNA和Cyclin D1蛋白质表达均减少(P0.05);与常氧NCsi RNA组比较,转染m TERF1si RNA后,常氧m TERF1si RNA组m TERF1m RNA及蛋白质表达明显减少(P0.05),而FAK、Cyclin D1m RNA及蛋白质表达无明显变化(P0.05)。与低氧NCsi RNA组比较,转染m TERF1si RNA后,低氧m TERF1si RNA组m TERF1m RNA及蛋白表达明显减少(P0.05),低氧下CCND1m RNA和CCND1蛋白表达减少(P0.05),而FAKm RNA及FAK蛋白质表达改变不明显(P0.05)。免疫荧光检测显示常氧FAKsi RNA组与常氧NCsi RNA组相比较,FAK是si RNA荧光表达下降明显(P0.05),Cyclin D1的荧光表达变化不明显(P0.05)。低氧下,FAKsi RNA组较NCsi RNA组相比,其FAK荧光表达明显下降(P0.05),Cyclin D1的荧光表达也随之降低(P0.05)。结论:低氧诱导下,沉默FAK可致人肺动脉平滑肌细胞m TERF1、Cyclin D1表达减少,且抑制HPASMCs增殖,而沉默m TERF1后Cyclin D1表达减少,FAK表达无明显改变。提示FAK是通过m TERF1/cyclin D1通路信号参与低氧状态下人肺动脉平滑肌细胞的增殖。
【关键词】：低氧 黏着斑激酶 线粒体转录终止1 细胞周期蛋白1 肺动脉平滑肌细胞
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R544.1
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 主要中英文对照9-10
• 主要仪器及试剂10-16
• 前言16-18
• 第1章 原代细胞培养及鉴定18-22
• 1.1 培养原代HPASMCs18-19
• 1.1.1 组织取材18
• 1.1.1.1 取材对象18
• 1.1.1.2 取材地点18
• 1.1.1.3 取材步骤及内容18
• 1.1.2 细胞培养18-19
• 1.1.2.1 肺动脉分离18
• 1.1.2.2 分离肺动脉平滑肌18
• 1.1.2.3 组织贴片法18-19
• 1.1.2.4 细胞传代19
• 1.2 人肺动脉平滑细胞的鉴定19-22
• 1.2.1 倒置显微镜下形态鉴定20
• 1.2.2 α-actin免疫组化法鉴定20
• 1.2.3 钙调节蛋白-1 免疫荧光法鉴定20-22
• 第2章 实验方法22-34
• 2.1 实验分组22
• 2.2 细胞转染22-24
• 2.2.1 小干扰设计及序列号22-23
• 2.2.2 转染方法及过程23-24
• 2.3 Realtime PCR24-27
• 2.3.1 引物设计及序列号24
• 2.3.2 细胞RNA的提取24-25
• 2.3.3 紫外线吸光法鉴定细胞RNA纯度及浓度25-26
• 2.3.4 逆转录及cDNA合成26
• 2.3.5 PCR扩增26-27
• 2.4 Western-blot27-31
• 2.4.1 细胞总蛋白提取27-28
• 2.4.2 BCA法测定蛋白浓度28
• 2.4.3 SDS-PAGE电泳28-29
• 2.4.4 转膜29-30
• 2.4.5 免疫反应30
• 2.4.6 蛋白信号曝光，显影，定影30-31
• 2.4.7 凝胶图像分析31
• 2.5 免疫荧光31-32
• 2.6 细胞增殖检测（CCK8法）32-34
• 第3章 统计分析34-36
• 第4章 实验结果36-44
• 4.1 RT-PCR检测FAK、mTERF1、CyclinD1mRNA的表达36-37
• 4.2 Western-Blot检测FAK、m TERF1、CyclinD1蛋白表达37-39
• 4.3 免疫荧光检测FAK、CyclinD1蛋白表达39-42
• 4.4 CCK8检测人肺动脉平滑肌细胞增殖42-44
• 第5章 讨论44-48
• 第6章 结论48-50
• 参考文献50-54
• 附录54-56
• 综述 FAK在COPD呼吸道平滑肌细胞增殖中作用机制的研究进展56-68
• 参考文献65-68
• 致谢68-69

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1 杨慧;FAKsiRNA通过下调mTERF1、CyclinD1抑制低氧诱导下人肺动脉平滑肌细胞增殖机制的研究[D];南华大学;2015年

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本文编号：879701