白细胞介素-8对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响及芎芍胶囊的干预效应研究

发布时间：2017-09-22 06:03

  本文关键词：白细胞介素-8对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响及芎芍胶囊的干预效应研究

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【摘要】：冠心病是冠状动脉粥样硬化性心脏病的简称,是指冠状动脉发生严重粥样硬化或痉挛,使冠状动脉狭窄或阻塞,以及血栓形成造成管腔闭塞,导致心肌缺血缺氧或梗死的一种心脏病,而炎症是其基本的病理基础,贯穿于冠心病发生发展的整个过程。 现代医学研究表明,炎症在动脉粥样硬化形成初期即发挥重要作用,大量炎症因子导致血管局部中性粒细胞和单核细胞的浸润,促进动脉内膜脂质沉积,从而导致动脉粥样硬化脂纹形成等早期病变的发生。而且,炎症是易损斑块的最显著特征之一,可发生于易损斑块的纤维帽和外膜中。AS斑块帽中激活的巨噬细胞有可能通过MMPs、细胞因子和其他参与炎症的介质导致斑块破裂,引发急性冠状动脉综合征(ACS)的发生与发展。因此,慢性炎症是动脉粥样硬化的标志,与心血管疾病相关,在AS的进展过程中起主要作用。 本课题组前期应用寡核苷酸基因芯片技术构建了冠心病血瘀证白细胞差异基因表达谱,筛选出若干差异表达基因,包括IL-8(白细胞介素8)、FcγRⅢA(免疫球蛋白IgG结晶片段受体Ⅲa)、PKCβ1(蛋白激酶Cβ1)、HLA-DQB1(主要组织相容性复合体Ⅱβ1)、FOLR3(叶酸受体γ3)和PTGDS(前列腺素D2合成酶)等。运用基因本体论和显著性通路分析方法,发现大部分冠心病血瘀证标志分子与炎症反应相关,而且Signal-Net网络拓扑技术分析发现这些差异基因在冠心病血瘀证疾病网络中处于关键的调控环节。本研究课题拟对目标分子之IL-8在冠心病血瘀证形成中的作用进行分析。 本论文分为两部分：文献综述和实验研究。 1文献综述：p38MAPK信号通路与细胞激活。 2实验研究：包括以下四个部分。 研究一ox-LDL对人脐静脉内皮细胞的损伤研究 目的：观察ox-LDL对人脐静脉内皮细胞损伤的时间效应研究。 方法：以体外培养人脐静脉内皮细胞为研究对象,加入ox-LDL培养不同作用时间分组：高糖培养基中加入终浓度为100ug/ml的ox-LDL,分别培养0h,6h,12h,24h,48h。进行细胞形态学观察及相关指标检测。 结果：①细胞形态学观察和细胞活性检测显示：与0h组相比,ox-LDL与HUVECs作用不同时间都能使细胞活性明显降低(P0.05,P0.01),LDH漏出率明显增加(P0.05,P0.01),并呈明显的时间依赖性。 ②生化指标检测显示：与Oh组相比,ox-LDL与HUVECs作用不同时间均能使ET-1释放含量明显增多,并在12h内呈时间依赖性,12h达峰值,其后释放量逐渐减少；与0h组相比,ox-LDL与HUVECs作用不同时间均使NO释放量减少,且随时间延长,可明显降低内皮细胞上清液中NO的含量,以24h时含量最低(P0.01)。与0h组相比,ox-LDL与HUVECs作用不同时间均能使炎症因子IL-8、IL-1β、E-selectin、ICAM-1释放含量增加。其中IL-8的表达量结果显示在0-12h内呈明显的时间依赖性,与0h组相比,差异有统计学意义(P0.01),12h后含量逐渐降低；IL-1β、ICAM-1的表达量结果显示在0-24h内呈明显的时间依赖关系,并于12h和24h组增加显著(P0.01),其后释放量有较明显的下降；E-selectin的表达于6h至峰值,含量最高(P0.01),6h-12h释放量基本降至基底水平。 结论：①在0-24h内,ox-LDL对人脐静脉内皮细胞的损伤逐渐加重；②ox-LDL短期干预人脐静脉内皮细胞即可引起大量炎症因子的释放,其中IL-8的表达量在0-12h内逐渐达到高峰值。 研究二IL-8在人外周血中性粒细胞-脐静脉内皮细胞粘附中的作用及芎芍胶囊的干预效应研究 目的：研究IL-8对人中性粒细胞-脐静脉内皮细胞粘附的影响及芎芍胶囊的干预效应。 方法：分离、鉴定并培养人脐静脉内皮细胞和外周血中性粒细胞,将VEC按1×108/L接种于96孔板,24h后分别按下列分组加入相应的受试药物或溶剂：①空白对照组；②IL-8组(终浓度100ng/mL)；③IL-8+芎芍胶囊小剂量组；④IL-8+芎芍胶囊大剂量组；⑤IL-8+辛伐他汀组,每组六个复孔,并重复3次独立实验。各用药组添加10%相应的含药血清,空白对照组、模型组加入等量的正常大鼠血清。 结果：瑞姬染色显微镜下细胞形态学观察鉴定人外周血中性粒细胞,倒置相差显微镜细胞形态学观察和Ⅷ因子相关抗原间接免疫荧光方法鉴定人脐静脉内皮细胞。与空白对照组相比,IL-8组可使内皮细胞所粘附的PMN数量明显增加(P0.01)；和模型组相比,辛伐他汀组、芎芍胶囊大、小剂量组均可不同程度抑制内皮细胞与PMN的粘附,其中,辛伐他汀组、芎芍胶囊大剂量组对IL-8刺激的内皮细胞与PMN粘附率的抑制作用具有显著差异(P0.01),呈剂量依赖性。 结论：IL-8介导中性粒细胞-内皮细胞的粘附,芎芍胶囊可不同程度地减轻其粘附,改善炎症反应,呈剂量依赖性。 研究三IL-8对人脐静脉内皮细胞p38MAPK信号通路的影响及芎芍胶囊的干预效应研究 目的：观察IL-8对人脐静脉内皮细胞p38MAPK信号通路的影响及芎芍胶囊对其的干预效应。 方法：以体外培养人脐静脉内皮细胞为研究对象,分组情况如下：①正常对照组(以下简称NOR组)：在无任何刺激因素的情况下培养内皮细胞；②IL-8组(终浓度100ng/mL);③IL-8+SB203580组(以下简称SB组)：先给予5μmol/LSB203580预处理30min,再给以刺激因子；④IL-8+芎芍胶囊组(以下简称XSC组)。芎芍胶囊药物组添加10%相应的含药血清,空白对照组、模型组、抑制剂组加入等量的正常大鼠血清。进行细胞形态学观察和细胞活性检测,取细胞培养上清液检测LDH漏出含量。Western blot法检测细胞p38MAKP, p-p38MAKP和iNOS蛋白表达水平。 结果：①细胞形态学观察和细胞活性检测显示：与正常对照组相比,IL-8模型组细胞活性明显降低(P0.01),LDH漏出率明显增加(P0.01)；与模型组相比,IL-8拮抗剂(SB203580)组和芍芎胶囊(XSC)组细胞活性明显升高(P0.01),LDH漏出率明显降低(P0.01)。 ②p-p38MAPK和iNOS蛋白检测显示：与正常对照组相比,IL-8模型组内皮细胞p-p38MAPK蛋白表达明显增加(P0.01)。与IL-8模型组比较,SB组和XSC组p-p38MAPK蛋白表达明显减少(P0.01)；而与正常对照组相比,IL-8模型组内皮细胞iNOS蛋白表达明显增加(P0.01)；与IL-8模型组比较,SB组和芎芍组iNOS蛋白表达量降低(P0.01)。 结论：IL-8诱导内皮细胞功能损伤与p38MAPK信号通路相关蛋白磷酸化水平升高密切相关,而芎芍胶囊可降低其磷酸化水平 研究四IL-8对ApoE-/-小鼠主动脉粥样硬化斑块稳定性的影响及芎芍胶囊的干预效应研究 目的：研究IL-8对ApoE-/-小鼠主动脉粥样硬化斑块稳定性的影响及芎芍胶囊的干预效应。 方法：90只8周龄雄性ApoE-/-小鼠高脂喂养12周后形成AS模型,并同时给予不同干预分为：ApoE-/-组(模型组)、ApoE-/-+辛伐他汀组(Sm组)、ApoE-/-+IL-8拮抗剂组(Reparixin组)、ApoE-/-+XSC高剂量组(XSCH组)和ApoE-/-+XSC低剂量组(XSCL组),每组18只。与ApoE-/-小鼠具有相同遗传背景的C57BL/6J小鼠18只作为对照组,普通饲料喂养12w。 ①主动脉组织病理学观察：主动脉根部组织石蜡切片HE染色。 ②血液学指标检测：生化法检测血脂(TC、TG、LDL-C、HDL-C);流式细胞术检测外周血中性粒细胞CDllb/CD18表达；双抗体夹心ABC-ELISA法检测血清IL-8、IL-1和sE-selectin水平 ③取整根主动脉,用于相关蛋白p38MAPK, p-p38MAPK, MMP-9和iNOS的Western-blot检测。 结果：①模型组小鼠主动脉粥样硬化斑块含有大量泡沫细胞。IL-8拮抗剂可改善动脉粥样硬化的作用,该作用与Sm相似。 ②模型组小鼠血脂TC、TG、LDL-C水平升高,HDL-C水平降低,外周血中性粒细胞CD11b/CD18高表达,血清IL-8、IL-1和sE-selectin水平较对照组显著升高(P0.01)；XSC和Reparixin组对TC、TG、LDL-C水平均有不同程度降低,同时能降低外周血中性粒细胞CD11b/CD18表达,且不同程度降低血清IL-8、IL-1和sE-selectin水平,对ApoE-/-小鼠体内炎症水平的改善作用XSCH与Sm相似。 ③模型组小鼠主动脉MMP-9和p-p38MAPK蛋白水平均较对照组显著升高(P0.01),上述指标在XSC与Reparixin组有不同程度改善且作用与Sin组相似,对动脉粥样硬化斑块具有稳定作用。 结论：①IL-8对小鼠主动脉粥样硬化斑块的稳定性具有一定影响。 ②芎芍胶囊减轻炎症反应、稳定斑块作用在一定程度上与下调IL-8表达水平有关。
【关键词】：冠心病血瘀证 白细胞介素-8 内皮细胞 ApoE~(-/-)小鼠 炎症 芎芍胶囊
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R285.5;R543.5
【目录】：

• 缩略词表6-8
• 摘要8-12
• Abstract12-17
• 文献综述 p38MAPK信号通路与内皮细胞激活17-27
• 一、 内皮细胞的激活17-19
• 二、 p38MAPK信号通路19-21
• 三、展望21-23
• 参考文献23-27
• 前言27-31
• 参考文献28-31
• 实验研究31-77
• 第一部分 ox-LDL对人脐静脉内皮细胞损伤的研究31-41
• 材料与方法31-33
• 结果33-36
• 讨论36-39
• 结论39
• 参考文献39-41
• 第二部分 IL-8在人外周血中性粒细胞-脐静脉内皮细胞粘附中的作用及芎芍胶囊的干预研究41-49
• 材料与方法41-44
• 结果44-45
• 讨论45-47
• 结论47
• 参考文献47-49
• 第三部分 IL-8对人脐静脉内皮细胞p38MAPK信号通路的影响及芎芍胶囊的干预效应研究49-57
• 材料与方法49-52
• 结果52-54
• 讨论54-55
• 结论55-56
• 参考文献56-57
• 第四部分 IL-8对ApoE~(-/-)小鼠主动脉粥样硬化斑块稳定性的影响及芎芍胶囊的干预效应研究57-77
• 材料与方法57-60
• 结果60-67
• 讨论67-72
• 结论72
• 参考文献72-77
• 论文小结77-79
• 致谢79-81
• 个人简历81

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