Compound K对动脉粥样硬化形成的影响及初步机制研究

发布时间：2017-09-28 08:38

  本文关键词：Compound K对动脉粥样硬化形成的影响及初步机制研究

  更多相关文章： 组分K 动脉粥样硬化 GW3965 肝X受体α 胆固醇逆转运 NLRP3炎症小体

【摘要】：动脉粥样硬化导致的心血管疾病严重地影响着人类生命健康。现有的抗动脉粥样硬化药物主要是一些以降血脂为主要目的的药物,例如贝特类、他汀类、胆汁酸隔离剂、烟酸类等,然而因贝特类、胆汁酸隔离剂和烟酸类药物易产生严重胃肠道不适、肝肾功能损害等副反应,且存在选择性低、易耐受等局限性,所以现已较少使用。目前使用最广泛的抗动脉粥样硬化药物是他汀类药物,但其也具有肌肉疼痛、肝脏毒性等副作用。且在已经广泛使用他汀类药物防治动脉粥样硬化的情况下,动脉粥样硬化导致的心血管疾病发病率仍居高不下,提示除高血脂外,仍可能存在其他危险因素。炎症免疫因素在动脉粥样硬化发病中具有重要作用是近年来的最重要进展之一。本实验室前期在多种动物模型的研究证明持续炎症刺激能够使动脉粥样硬化发病提前、病变加重及斑块不稳定性增加,而抗炎治疗则能明显减轻动脉粥样硬化形成;与此同时我们观察到多种细胞因子如IL-1可促使白细胞黏附至内皮细胞,IL-18上调巨噬细胞和内皮细胞黏附分子、血管细胞黏附分子的表达,进而与动脉粥样硬化发病有密切关系。近年有研究发现NOD样受体蛋白3(Nod-like receptor protein-3,NLRP3)炎症小体在被多种刺激因素激活后,能切割IL-1β和IL-18的前体,使IL-1β和IL-18成熟并释放到胞外从而引起炎症反应。且相较其他亚家族成员而言,NLRP3炎症小体在血管平滑肌细胞中是最主要的导致成熟IL-1β释放的因素,因此抑制NLRP3炎症小体活性极有可能减轻动脉粥样硬化形成。上述分析提示,从调节血脂和降低炎症反应两个方面同时采取干预措施将极有望成为防治动脉粥样硬化的新策略。本实验室既往研究还发现,作为三七的主要有效部位的三七总皂苷(panax notoginseng Saponins,PNS),其良好防治动脉粥样硬化的作用与其抗炎作用密切相关;我们的预实验显示,作为PNS体内代谢活性成分的Compound K(CK,20-O-b-D-glucopyranosyl-20(S)-protopanaxadiol)是,具有良好的抗动脉粥样硬化作用;且PNS减少泡沫细胞形成的作用与其增加LXRα下游靶基因ABCA1的表达水平有关,而且可以通过增加LXRα表达从而减少大鼠动脉粥样硬化斑块形成;但其对动脉粥样硬化形成的系统影响和作用机制尚未见报道。为此,本课题拟系统探讨CK对动脉粥样硬化形成的影响,并从胆固醇逆向转运(Reverse cholesterol transport,RCT)过程和NLRP3炎症小体活性两个方面对其机制进行初步探索。旨在进一步深化对动脉粥样硬化发病机理的认识,并为CK的成药性研究提供实验依据。方法:1.实验动物及处理:雄性C57BL/6 apo E-/-小鼠42只,8周龄,在SPF级房间内适应性饲养一周后,被随机分成7组(n=6),除对照组采用基础饲料喂养外,其余均进行高脂饮食。每天进行腹腔注射给药一次,持续12周。给药情况如下:对照组给予20ml/kg生理盐水;模型组在高脂饮食情况下给予20ml/kg生理盐水;第3、4、5组分别给予1、3、9mg/kg的CK;GGPP组为3mg/kg CK和9mg/kg GGPP混合给药;阿托伐他汀组剂量为2.6mg/kg。期间每周监测并记录一次小鼠体重变化情况,12周后取材。2.将主动脉窦进行固定和包埋后进行切片,然后作HE染色,倒置显微镜下观察样品并拍照,进行组织学分析。冰冻病理切片方法用于处理小鼠肝脏组织,然后进行油红“O”染色,光镜下观察肝脏脂质沉积情况,并用Nis-Elements BR 3.2软件进行图像分析处理。3.对各组小鼠进行摘眼球取血,每只小鼠约取500μl的血样,立即于4℃离心10min,3000rpm.然后各取200μl上清用AU-2700自动生化分析仪进行血脂指标检测。4.获取每只小鼠200μl左右的血清,按照Millpex catalog ID试剂盒步骤,对其中具有代表性的炎症因子(TNF-α,IL-1β和IL-6)进行表达水平检测。5.提取小鼠动脉、小肠和肝脏蛋白,检测动脉中LXRα、ABCA1、ABCG1;小肠ABCG5、ABCG8和肝脏SREBP-1c表达情况。6.提取动脉和肝脏组织的蛋白,用Western blot方法进行目标蛋白NLRP3,Caspase-1及IL-1β等的表达水平检测。7.培养C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞源泡沫细胞,按如下分组给药操作:对照组、ox-LDL(100μg/ml)模型组、低剂量CK组(ox-LDL+3.3μM CK)、中剂量CK组(ox-LDL+10μM CK)、高剂量CK组(ox-LDL+30μM CK)、CK+GGPP组(ox-LDL+10μM CK+10μM GGPP)、GW3965组(ox-LDL+10μM GW3965),培养24h,检测泡沫细胞中胆固醇含量。8.提取C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞源泡沫细胞总蛋白,检测ABCA1蛋白表达情况。9.对数生长期细胞用PMA诱导24h使其形成贴壁巨噬细胞后按如下分组处理:对照组、胆固醇(1μg/L)模型组、高剂量GW3965组(胆固醇+30μM GW3965)、中剂量GW3965组(胆固醇+10μM GW3965)、低剂量GW3965组(胆固醇+3.3μM GW3965)、GW3965+GGPP组(10μM GW3965+10μM GGPP)、GGPP组(10μM GGPP)、ABCA1antibody组(10μM GW3965+1:200 ABCA1antibody)、apo E组(10μM GW3965+1:200 apo E antibody)。另外,将诱导成功的巨噬细胞用于检测LPS的作用,即取100ng/ml LPS作LPS模型组,其余分组为在LPS模型基础上给予与上述一致的药物。提取总RNA和总蛋白,检测NLRP3、Caspase-1、IL-1β等表达。10.培养C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞源泡沫细胞,分组和给药方式同上所述。提取总蛋白,检测NLRP3、Caspase-1和IL-1β等表达变化情况。结果:1.对apo E-/-小鼠动脉进行切片及HE染色后光镜下观察发现,对照组动物主动脉无可见粥样硬化斑块,模型组小鼠主动脉则有明显的病变出现,病变面积达15.05±1.97%,3mg/kg和9mg/kg组动物主动脉中斑块面积都显著下降为6.58±1.09%和2.16±0.62%。2.光镜下观察发现油红“O”染色的模型组小鼠肝脏有大量脂滴沉积在肝脏中,阳性染色面积比为32.00±4.91%;分别给予3mg/kg和9mg/kg的CK处理后,肝脏内脂滴明显减少,阳性面积比分别为11.85±2.40%和4.07±0.76%;同样地,阿托伐他汀组脂沉积也显著减少,为4.39±1.08%;GGPP组与模型组相比,无明显差异。3.模型组apo E-/-小鼠的血清TC,TG,LDL和HDL水平较对照组有显著增加;阿托伐他汀能明显下调TC和LDL水平;与模型组比较,所有CK组的TC和TG水平均无明显变化,然而3mg/kg CK组和9mg/kg CK组的LDL水平均明显降低,HDL水平明显升高;GGPP组较模型组无显著变化。4.泡沫细胞结果显示,与模型组相比,CK可以剂量依赖性地减少泡沫细胞中胆固醇的沉积,GGPP能够抑制CK的作用从而使泡沫细胞中胆固醇含量增多,GW3965作为CK的阳性对照药,也能显著地降低泡沫细胞生成。5.在动物和细胞两个水平上CK能剂量依赖地增加LXRα,ABCA1及ABCG1等蛋白的表达水平。6.LXRα激动剂GW3965能够剂量依赖性地降低NLRP3和Caspase-1的m RNA水平(p0.05)和蛋白(p0.05)水平,进而降低成熟IL-1β的产生,GGPP作为LXRα抑制剂能够显著抑制GW3965的活性。7.与对照组相比,高脂饮食的模型组中血清炎症因子IL-1β,IL-6和TNF-α表达水平显著增高;9mg/kg和3mg/kg的CK能显著下调其水平(p0.05);阿托伐他汀仅能减少IL-1β和TNF-α的表达(p0.05),而对IL-6水平无显著影响;GGPP能明显抑制CK的作用。8.CK在动物和细胞两个水平上能剂量依赖性地减少NLRP3,Caspase-1及IL-1β的表达,且GGPP能显著抑制其作用。结论:1.CK能够显著抑制动脉粥样硬化斑块的形成,且能减少肝脏中脂质的沉积。2.CK抑制动脉粥样硬化形成的作用与促进胆固醇逆转运和抑制NLRP3炎症小体活性有关。
【关键词】：组分K 动脉粥样硬化 GW3965 肝X受体α 胆固醇逆转运 NLRP3炎症小体
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543.5
【目录】：

• 缩写词表5-7
• 英文摘要7-12
• 中文摘要12-16
• 第一章 前言16-18
• 第二章 Compound K对apo E-/-小鼠主动脉动脉粥样硬化形成的影响18-30
• 2.1 材料与方法18-22
• 2.2 结果22-28
• 2.3 讨论28-29
• 2.4 小结29-30
• 第三章 Compound K抑制apoE-/-小鼠动脉粥样硬化形成的初步机制研究30-63
• 3.1 Compound K抑制动脉粥样硬化的形成与激活LXRα 有关30-37
• 3.1.1 材料与方法31-36
• 3.1.2 结果36-37
• 3.2 Compound K抑制动脉粥样硬化形成的作用与促进胆固醇逆转运有关37-41
• 3.2.1 材料与方法37-39
• 3.2.2 结果39-41
• 3.3 Compound K能够降低病变局部NLRP3炎症小体活性41-59
• 3.3.1 材料与方法42-47
• 3.3.2 结果47-59
• 3.4 讨论59-62
• 3.5 小结62-63
• 全文结论63
• 特色与展望63-64
• 参考文献64-69
• 文献综述 NLRP3炎症小体与动脉粥样硬化69-79
• 参考文献74-79
• 在读硕士期间发表论文79-80
• 致谢80

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1 于兆慧;人参稀有皂苷Compound K的酶法制备及其混合胶束的研究[D];南京中医药大学;2015年

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本文编号：934867