缺氧预处理对心脏干细胞在缺血环境中生存的作用及机制研究

发布时间：2017-10-02 10:21

  本文关键词：缺氧预处理对心脏干细胞在缺血环境中生存的作用及机制研究

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【摘要】：目的:动脉粥样硬化所致的心肌梗死、脑血管疾病和周围血管疾病等,在近年来世界范围内已成为中老年人死亡的主要原因之一。干细胞治疗则是针对这些缺血性疾病所出现的一种新的治疗策略,其中CSCs是目前研究的热点,其自我更新、克隆增殖和多向分化的能力,在心脏损伤修复和维持心脏结构和功能完整性方面具有重要作用,而c-kit+CSCs是心肌组织内最特异性的干细胞。但是在移植区域恶劣的微环境大大降低了干细胞的作用。细胞预处理是改善这一现象的重要手段,其中缺氧预处理则是保护细胞的临床可行的方法。多项研究均显示缺氧预处理对多种细胞的保护作用。缺氧条件下,Nrf2及其激活的下游基因HO-1在细胞生存和抵抗不良环境的防御方面具有关键的作用。研究显示HIF-1α及下游靶基因VEGF对细胞有促生存作用,特别是VEGF以旁分泌方式改善内皮细胞生存和血管生成,且Nrf2活性与HIF-1α的表达水平呈正相关。但目前尚未有缺氧预处理(HPC)对CSCs中Nrf2/ARE通路的作用及相关机制的报道。因此,本研究拟通过缺氧预处理心脏干细胞后检测其在不同状态下的细胞存活情况,并检测Nrf2、HIF-1α及VEGF等指标的表达情况,以初步探讨其作用及相关机制。方法:1.按照本课题组前期已成熟的CSCs培养方法培养SD大鼠的CSCs,通过免疫磁珠法筛选c-kit+CSCs,行流式细胞术鉴定其纯度,并进行随后的实验;2.以不同缺血时间(0,12,24h)处理CSCs,收集细胞后行流式细胞术检测CSCs的细胞周期,确定模拟缺血微环境的最佳时间;3.以不同缺氧时间(0,6,12,24,30h)处理CSCs,通过CCK8法检测不同处理组CSCs的细胞活力,通过流式细胞术检测各组CSCs的凋亡率、存活率及坏死率,确定缺氧预处理CSCs的最佳时间;4.对照组不予任何处理,缺氧组只缺氧处理6h;缺血组只缺血处理24h;缺氧+缺血组在缺氧处理6h后再进行缺血处理,然后收集各组细胞行流式细胞术检测各组CSCs的凋亡;5.对照组不予任何处理,缺氧组只缺氧处理6h;缺血组只缺血处理24h;缺氧+缺血组在缺氧处理6h后再进行缺血处理,免疫荧光检测Nrf2在不同处理中的表达情况;Western blot检测Nrf2、HO-1、HIF-1α及VEGF在各组中的蛋白表达情况;6.对照组不予任何处理,Nrf2(+)组用tBHQ处理12h,缺氧组只缺氧处理6h,Western blot检测HIF-1α及VEGF在各组中的蛋白表达情况。结果:1.体外分离培养的原代CSCs在第3天时呈圆形亮点状贴于培养瓶底部;培养至第7天时贴壁良好,细胞呈梭形、三角形、多角形;在第12天时细胞生长均匀,大约可达到80%-90%的融合。磁珠分选后的CSCs在倒置显微镜下可见细胞呈圆点状散布于培养基中,表面结合有单个或多个磁珠,在3天左右可看到有少量细胞贴壁,细胞表面仍有单个或多个磁珠结合,在7天左右细胞迅速增殖,而且磁珠在镜下几乎观察不到,在10天左右细胞几乎铺满培养瓶。流式细胞术检测CSCs表面标记显示:c-kit+89.8%,CD34 1.9%,CD45 1.7%;2.流式细胞术显示这三组细胞(缺血0,12,24h)大部分处于G0-G1期,而S期的比例随着缺血时间的延长而显著降低。因此,选定缺血24h来模拟缺血微环境;3.CCK8法检测不同的缺氧时间(0,6,12,24,30h)预处理CSCs的细胞活力,与对照组相比,缺氧6h的细胞活力明显增加,但随着时间增长,细胞活力无明显增加,并且在缺氧30h时细胞活力明显降低;以流式细胞术检测各个处理时间的细胞凋亡情况。缺氧6h后细胞凋亡率增加,为4.5%,与对照组相比,有统计学意义(P0.05);随着时间的延长,凋亡率出现缓慢上升,但与缺氧6h相比,其差异无统计学意义(P0.05);但是当缺氧30h时,与对照组相比,存活率明显降低,而凋亡率显著升高,其差异有统计学意义(P0.05),由此确定缺氧6h为CSCs缺氧预处理的最佳时间;4.流式细胞术检测不同处理后各组的细胞凋亡情况,缺氧组与对照组相比差异有统计学意义(P0.05),而先进行缺氧预处理后再进行缺血的CSCs的细胞凋亡率与缺血组相比,其凋亡率显著降低(P0.05)。由此可以证明,缺氧预处理可以有效地降低缺血导致的细胞凋亡;5.免疫荧光显示Nrf2在缺氧条件下表达增多;Western blot检测显示与对照组相比,Nrf2、HO-1、HIF-1α及VEGF的表达在缺氧条件下增加(P0.05);6.Western blot检测显示与对照组相比,缺氧预处理和Nrf2(+)组中的HIF-1α及VEGF的表达增加(P0.05)。结论:1.HPC可减少由缺血诱导的CSCs凋亡,其中的机制可能是通过激活Nrf2/ARE信号通路,从而发挥其抗氧化应激及细胞保护作用所致的;同时,HPC会上调HIF-1α及VEGF的表达,从而促进细胞生存。2.在CSCs中Nrf2/ARE的激活能够上调HIF-1α及VEGF的表达。
【关键词】：心肌梗死 氧化应激 心脏干细胞 缺氧预处理 Nrf2/ARE
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54
【目录】：

• 英汉缩略词对照表4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 1 材料与方法14-25
• 2 结果25-36
• 3 讨论36-41
• 4 结论41-42
• 参考文献42-47
• 综述47-55
• 参考文献52-55
• 致谢55-57
• 作者简介57

【参考文献】

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1 刘明波;王文;周脉耕;;2004—2010年中国心血管病死亡流行趋势分析[J];中华流行病学杂志;2013年10期

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本文编号：959076