DNA甲基化介导的氧化应激相关基因CRYAA及GJA3在年龄相关性核性白内障中的筛选及作用机制研究

发布时间：2017-10-12 16:18

  本文关键词：DNA甲基化介导的氧化应激相关基因CRYAA及GJA3在年龄相关性核性白内障中的筛选及作用机制研究

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【摘要】：第一部分DNA甲基化介导的氧化应激相关基因在年龄相关 目的年龄相关性白内障(ARC)是全球首位致盲性眼病,氧化应激在ARC的发病中起到重要作用。本研究旨在通过全基因组启动子区DNA甲基化芯片对年龄相关性核性白内障患者的晶状体上皮囊膜和眼库中年龄匹配的无明显白内障的眼球的晶状体上皮囊膜进行检测分析,筛选出由DNA甲基化调控的与氧化应激相关的基因,并进行验证。 材料与方法收集白内障手术中撕下的晶状体前囊膜30例作为ARC组,入选标准为60岁以上核性ARC患者,LOCS III分级为NC≥4级；对照组选取我院眼库来源的无明显白内障的眼球晶状体前囊膜30例,两组囊膜提取基因组DNA。用全基因组启动子区DNA甲基化芯片(Infinium(?)HumanMehlation450BeadChip,Illumina, USA)对ARC组与对照组各10例晶状体上皮囊膜进行检测分析,筛选出有差异的由DNA甲基化调控的与氧化应激相关的基因。再各选取ARC组与对照组各10例晶状体上皮囊膜,对筛选出来的基因进行生物信息学分析,用DNA甲基化检测的金标准方法焦磷酸测序法进行验证。 结果ARC组中核分级NC4级20例,NC5级7例,NC6级3例；对照组均为NC1级。DNA甲基化芯片筛选结果显示,与对照组相比,ARC组有254个基因启动子区DNA甲基化程度显著上调,有60个基因启动子区DNA甲基化程度显著下调(P0.001)。差异最大的前30个基因中CRYAA基因和GJA3基因与氧化应激密切相关,且与ARC的发病密切相关。CRYAA与GJA3基因启动子区均存在CpG岛,焦磷酸测序法验证结果显示,CRYAA基因启动子区ARC组的DNA甲基化程度为47.13±3.60%,显著高于对照组的35.89±5.88%,差异有统计学意义(P0.01)；GJA3基因启动子区ARC组的DNA甲基化程度为3.21±2.40%,显著高于对照组的1.80±1.20%,差异有统计学意义(P0.01)。 结论本研究通过DNA甲基化芯片筛选及验证,首次发现随着年龄增加,CRYAA及GJA3等氧化应激相关的与白内障发病密切相关的基因启动子区DNA甲基化程度增加,说明表观遗传学机制DNA甲基化在ARC的发病中起到重要作用,为进一步研究其作用机制奠定了基础。 目的αA晶状体蛋白(CRYAA基因编码)具有分子伴侣功能,对维持晶状体的透明性起到关键作用；缝隙连接蛋白Cx46(GJA3基因编码)的广泛的网络作用对维持晶状体细胞间的通讯和分子交换起到重要作用。这两个基因均对维持晶状体的抗氧化平衡状态至关重要,本研究将探讨年龄相关性核性白内障患者CRYAA及GJA3基因启动子区DNA高甲基化的作用机制。 材料与方法收集白内障手术中撕下的晶状体前囊膜12例作为ARC组,入选标准为60岁以上核性ARC患者,LOCS III分级为NC≥4级；对照组选取我院眼库中年龄匹配的无明显白内障的眼球的晶状体前囊膜12例。取两组前囊膜各6例提取总RNA,用Real Time RT-PCR法检测CRYAA及GJA3基因在mRNA水平的表达；另取两组前囊膜各6例提取蛋白,通过Western blot法分析a A-晶状体蛋白量和Cx46蛋白量的变化,分析CRYAA及GJA3基因DNA甲基化在mRNA及蛋白水平对基因表达的影响。选取CRYAA及GJA3基因焦磷酸测序结果DNA甲基化程度两组间差异最大的CpG位点,在体外构建该CpG位点甲基化的DNA探针与野生型DNA探针,提取人晶状体上皮细胞系SRA01/04的核蛋白,通过凝胶电泳迁移实验(EMSA)比较核蛋白与两种探针的结合情况,Supershift反应比较转录因子SP1与两种探针的结合影响,分析DNA甲基化对转录因子调控的影响。 结果Real Time RT-PCR结果显示ARC组的CRYAA及GJA3基因的mRNA表达均显著低于对照组(p0.01),而Western blot结果是ARC组的CRYAA及GJA3基因的蛋白表达量低于对照组。EMSA结果显示CRYAA基因的甲基化DNA探针与核蛋白的结合低于野生型DNA探针；核蛋白与野生型探针的结合可被野生型探针竞争,而不能被甲基化探针竞争；Supershift反应显示转录因子SP1与甲基化DNA探针的结合低于野生型DNA探针。GJA3的EMSA结果则为阴性,其甲基化DNA探针与核蛋白的结合与野生型DNA探针程度无显著差异,Supershift反应转录因子SP1与两种探针的结合也为无显著差异。 结论CRYAA及GJA3基因启动子区的DNA高甲基化均影响了基因mRNA及蛋白水平的表达,CRYAA基因的DNA甲基化通过直接影响基因与转录因子的结合而抑制基因转录,GJA3基因的DNA甲基化并没有影响转录因子的结合,可能通过间接途径影响基因的转录,其机制还有待进一步进行研究。 目的DNA去甲基化药物Zebularine能抑制晶状体上皮细胞的DNMT1酶,抑制MeCp2,进而抑制晶状体上皮细胞的转化过程。本研究将探讨DNA去甲基化药物Zebularine对人晶状体上皮细胞的CRYAA及GJA3基因表达的干预效果。 材料与方法将永生性人晶状体上皮细胞系SRA01/04分为2组,分别加入Zebularine和PBS作为对照组。培养72小时后收集细胞,提取总RNA,用Real Time RT-PCR法检测CRYAA及GJA3基因在mRNA水平的表达；Zebularine干预后细胞提取蛋白,通过Western blot法分析a A-晶状体蛋白量和Cx46蛋白量的变化。 结果Zebularine可以有效干预人晶状体上皮细胞CRYAA及GJA3基因的表达。在mRNA表达水平,CRYAA及GJA3基因mRNA的表达量均为对照组显著低于Zebularine干预组,差异均具有统计学意义(P0.05)。在蛋白表达水平,CRYAA及GJA3基因均为对照组低于Zebularine干预组。 结论DNA去甲基化药物Zebularine在体外可以有效上调人晶状体上皮细胞CRYAA及GJA3基因的表达,为寻求治疗ARC的表观遗传学干预手段提供了基础实验支持。 关键词Zebularine;人晶状体上皮细胞；CRYAA;GJA3
【关键词】：年龄相关性白内障 氧化应激 表观遗传学 DNA甲基化 芯片 焦磷酸测序 CRYAA GJA3 CRYAA GJA3 DNA甲基化 人晶状体上皮细胞 EMSA 转录因子SP1
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R776.1
【目录】：

• 英文缩略语5-6
• 中文摘要6-11
• Abstract11-16
• 前言16-21
• 第一部分 DNA甲基化介导的氧化应激相关基因在核性ARC中的筛选及验证21-59
• 引言21-22
• 一、材料与方法22-40
• 1. 材料22-24
• 2. 方法24-40
• 二、结果40-55
• 1. 晶状体前囊膜标本临床资料40-41
• 2. DNA甲基化芯片分析41-50
• 3. 氧化应激相关基因的生物信息学分析50-51
• 4. 焦磷酸测序验证51-55
• 讨论55-59
• 第二部分 DNA甲基化介导的CRYAA及GJA3基因在核性ARC中作用机制研究59-78
• 引言59-61
• 一、材料与方法61-71
• 1. 材料61-63
• 2. 方法63-71
• 二、结果71-75
• 1. CRYAA及GJA3基因mRNA表达水平71-72
• 2. CRYAA及GJA3基因蛋白表达水平72-73
• 3. CRYAA及GJA3基因转录因子结合分析73-75
• 讨论75-78
• 第三部分 DNA去甲基化药物Zebularine在人晶状体上皮细胞中对CRYAA及GJA3基因表达的初步干预研究78-92
• 引言78-80
• 一、材料和方法80-87
• 1. 材料80-81
• 2. 方法81-87
• 二、结果87-89
• 1. CRYAA及GJA3基因mRNA表达水平87
• 2. CRYAA及GJA3基因蛋白表达水平87-89
• 讨论89-92
• 全文总结92-95
• 参考文献95-106
• 综述106-123
• 参考文献118-123
• 在读期间发表论文123-124
• 会议发言124-125
• 致谢125-127

【参考文献】

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1 J.B.Jonas;喻平平;;北京城乡地区致盲及视力损害原因的北京眼科研究[J];世界核心医学期刊文摘.眼科学分册;2006年11期

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本文编号：1019713