鼻咽癌发生相关下调基因筛选及Annexin A6基因在鼻咽癌中的表达研究

发布时间：2017-10-18 15:22

  本文关键词：鼻咽癌发生相关下调基因筛选及Annexin A6基因在鼻咽癌中的表达研究

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【摘要】：目的：首先以永生化的鼻咽上皮细胞株(NP69)和鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)细胞株(6-10B、5-8F)为研究模型,从蛋白表达谱入手,采用定量蛋白质组学技术筛选NPC中发生相关下调基因。而后从发生相关下调基因中选取Annexin A6(ANXA6)为研究对象,检测ANXA6基因在5-8F、6-10B和NP69细胞株中的甲基化情况,初步阐明ANXA6在NPC中表达下调的部分机制以及在NPC中的作用。 方法：培养永生化的鼻咽上皮细胞NP69和NPC细胞6-10B、5-8F,分别抽提蛋白质,测量蛋白浓度,采用同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ)结合二维液相色谱串联质谱(2DLC-MS/MS)的方法分离鉴定三株细胞的差异表达蛋白,实验重复两次。通过ProteinPilotTM4.2软件进行Swissprot蛋白数据库搜索及鉴定,从中筛选出6-10B和5-8F两株NPC细胞相对NP69表达都下调的差异蛋白,并进行生物信息学分析。进一步挑选ANXA6基因采用qRT-PCR (Quantitative Reverse transcriptase Polymerase chain reaction)检测5-8F、6-10B和NP69中mRNA的表达水平；采用蛋白印迹法(Western Blotting)验证ANXA6蛋白在5-8F、6-10B和NP69三株细胞中的表达水平；采用免疫组织化学检测ANXA6蛋白在NPC组织和鼻咽上皮组织中的表达情况,同时统计分析NPC中ANXA6蛋白表达水平与临床病理特征的关系；采用亚硫酸氢盐测序法检测ANXA6基因在5-8F、6-10B和NP69细胞株中的甲基化情况。应用SPSS17.0统计软件进行数据分析。 结果：根据筛选条件,筛选出两株NPC细胞相对NP69低表达的差异蛋白98个,经生物信息学分析发现,这些蛋白通过多种信号通路在鼻咽癌发生过程中发挥作用。挑选ANXA6进一步研究,qPCR和Western blotting结果显示mRNA和蛋白表达情况与iTRAQ的结果一致：NP69表达高于6-10B,6-10B表达高于5-8F,两两比较有统计学意义；免疫组织化学检测发现ANXA6在NPC组织中表达低于鼻咽上皮组织(P0.001),且ANXA6蛋白表达水平与NPC的淋巴结和远处转移、临床分期密切相关；亚硫酸氢盐修饰后基因测序发现NP69细胞ANXA6基因无甲基化,而6-10B和5-8F存在不同程度的甲基化,其甲基化百分比分别为25.6%、17.9%, NP69与6-10B和5-8F比较差异有统计学意义,而6-10B与5-8F比较差异无统计学意义。 结论：1、本研究以NPC细胞株5-8F、6-10B和永生化的鼻咽上皮细胞株NP69为研究模型,采用iTARQ结合2DLC-MS/MS的方法筛选出NPC发生相关下调基因98个。 2、ANXA6蛋白在细胞NP69.6-10B.5-8F中表达依次下降,且鼻咽上皮组织、未转移NPC组织、转移NPC组织表达依次下降。据此推测,ANXA6蛋白表达下调可能与NPC的发生和转移密切相关。 3、ANXA6表达下调/缺失与NPC远处转移、淋巴结转移和临床分期相关,ANXA6表达下调/缺失的NPC更易发生远处转移和淋巴结转移,临床分期更晚。 4、在NPC中ANXA6基因甲基化是导致其表达下调/缺失的重要原因之一,同时在转录水平还有其他的机制参与调控ANXA6的表达。 5、ANXA6可能是NPC的抑癌基因。图8幅,表8个,参考文献53篇
【关键词】：鼻咽癌 ANXA6 甲基化 iTRAQ 亚硫酸氢盐测序法
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.63
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-12
• 英文~.略词表12-13
• 第一章 鼻咽癌发生相关下调基因筛选13-27
• 1.1 绪论13-14
• 1.2 材料与方法14-19
• 1.2.1 主要实验材料14-16
• 1.2.2 实验方法16-19
• 1.3 结果19-26
• 1.3.1 筛选鼻咽癌发生相关下调蛋白19-23
• 1.3.2 生物信息学分析23-26
• 1.4 讨论26-27
• 第二章 Annexin A6基因在鼻咽癌中的表达研究27-51
• 2.1 绪论27-28
• 2.2 材料与方法28-41
• 2.2.1 主要实验材料28-33
• 2.2.2 实验方法33-41
• 2.2.3 统计学分析41
• 2.3 结果41-49
• 2.3.1 qRT-PCR检测ANXA6基因在5-8F、6-10B和NP69中mRNA表达水平41-43
• 2.3.2 蛋白浓度测定结果43
• 2.3.3 Western blotting验证ANXA6在三株细胞中的表达43-44
• 2.3.4 免疫组化染色检测ANXA6在鼻咽癌组织和非癌组织中的表达44-46
• 2.3.5 ANXA6甲基化检测结果46-49
• 2.4 讨论49-51
• 结论51-52
• 参考文献52-56
• 综述56-70
• 参考文献65-70
• 攻读硕士学位期间主要的研究成果70-71
• 致谢71

【参考文献】

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本文编号：1055680