间充质干细胞对实验性复发自身免疫性葡萄膜炎作用的研究

发布时间：2017-10-21 21:07

  本文关键词：间充质干细胞对实验性复发自身免疫性葡萄膜炎作用的研究

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【摘要】：目的葡萄膜炎是常见的致盲性眼病,病因及发病机制复杂,多种类型反复发作,治疗棘手。实验性复发自身免疫性葡萄膜炎动物模型(recurrent experimental autoimmune uveitis, rEAU)具有与人类慢性复发性葡萄膜炎相一致的临床特征,是研究葡萄膜炎病理机制和探索新型治疗方法的重要工具。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一种具有免疫抑制特性的多能成体干细胞,在体内外可抑制多种免疫细胞的增殖和功能。本实验研究MSCs对rEAU的治疗效果,观察临床及病理表现,检测脾脏T淋巴细胞增殖能力以及脾脏、颈部引流淋巴结和眼部辅助性T淋巴细胞(helper T lymphocyte,Th)17的比例,以阐明MSCs对rEAU的免疫调节机制,为临床治疗葡萄膜炎提供新的方法和理论基础。 方法 1. MSCs培养,分离纯化并鉴定Wistar大鼠骨髓MSCs。 2.rEAU模型建立：光感受器间维生素A类结合蛋白(interphotoreceptor retinoid-binding protein, IRBP)多肽片段R16与含有结核杆菌素H37RA2.5g/l的弗氏完全佐剂(Complete Freund's adjuvant, CFA)等体积混合充分乳化,单侧后肢足垫皮下注射,免疫Lewis大鼠建立EAU动物模型。免疫后第10天取EAU大鼠脾脏及引流淋巴结T淋巴细胞,R16抗原刺激条件下体外培养48小时,将1×107活化T淋巴细胞过继转移至Lewis大鼠建立rEAU动物模型。 3. MSCs治疗：24只rEAU大鼠随机分为PBS对照组和MSCs治疗组。过继免疫后第4天,即首次发病初发期,MSCs治疗组每日行5×106MSCs尾静脉注射治疗,PBS对照组行等体积PBS注射,连续3天。 4.临床观察：过继免疫后,每日在裂隙灯显微镜下观察rEAU大鼠眼部前节炎症反应,并根据Caspi I临床分级进行评分至第50天,即疾病慢性期。 5.组织病理学观察：过继免疫后第50天,处死rEAU大鼠并摘取双侧眼球制备视网膜组织切片,HE染色后行组织病理学观察。 6.5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine, Brdu)测定T淋巴细胞增殖：过继转移后第10天,即首次发病恢复期,取rEAU大鼠脾脏T淋巴细胞,不同浓度梯度(0、0.3、1、10μg/ml)R16抗原刺激条件下体外培养48小时,Brdu标记,继续培养8小时,加入Brdu抗体及显色工作液,酶标仪450nm波长处检测吸光度值。计算T淋巴细胞刺激增殖指数。 7.流式细胞分析CD4、白介素(mterleukin, IL-)-17阳性细胞：过继转移后第10天,即首次发病恢复期,分离rEAU大鼠脾脏、颈部引流淋巴结T淋巴细胞及眼部细胞,制备单细胞悬液,小鼠抗大鼠CD4、IL-17荧光抗体染色,流式细胞仪分析CD4+IL-17+细胞比例。 结果 1.成功分离纯化并鉴定大鼠MSCs。 2.成功建立大鼠rEAU模型。 3.临床观察显示,MSCs治疗降低rEAU50天内的临床平均分(P0.05),减少发病次数(P0.05),减低首次发病病程中的临床评分(P0.05)。 4.组织病理学观察显示,50天后眼部呈慢性炎症状态,MSCs治疗能够减轻炎性细胞浸润和视网膜组织结构的损伤。 5.Brdu测定T淋巴细胞增殖显示,脾脏T淋巴细胞增殖呈R16抗原依赖性,MSCs治疗能够抑制R16抗原特异性T淋巴细胞增殖的能力(P0.05)。 6.流式细胞分析CD4+IL-17+细胞显示,MSCs治疗能够降低脾脏、颈部引流淋巴结CD4+IL-17+细胞比例(P0.05),减少CD4+IL-17+细胞向眼部的浸润(P0.05)。 结论rEAU的发生发展与活化的R16抗原特异性T淋巴细胞密切相关,Thl7细胞及其细胞因子IL-17参与炎症过程。MSCs治疗可以有效减轻rEAU的临床及病理表现,其机制可能与抑制R16抗原特异性T淋巴细胞增殖能力,减少脾脏、颈部引流淋巴结及眼部Thl7细胞相关。
【关键词】：间充质干细胞 实验性复发自身免疫性葡萄膜炎 T淋巴细胞增殖 Th17细胞 流式细胞分析
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R773.9
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语/符号说明10-11
• 前言11-16
• 研究现状、成果11-14
• 研究目的、方法14-15
• 主要技术路线15-16
• 1. 实验材料和方法16-24
• 1.1 实验材料16-18
• 1.2 实验方法18-24
• 2. 实验结果24-35
• 2.1 间充质干细胞(MSCs)培养与鉴定24-25
• 2.2 实验性复发自体免疫性葡萄膜炎(rEAU)动物模型构建25-27
• 2.3 MSCs减轻rEAU临床表现27-31
• 2.4 MSCs改善rEAU组织病理学表现31-32
• 2.5 MSCs抑制抗原特异性T淋巴细胞增殖32-33
• 2.6 MSCs下调辅助性T细胞(Th)1733-35
• 3. 讨论35-41
• 结论41-42
• 参考文献42-47
• 发表论文和参加科研情况说明47-48
• 综述48-58
• 综述参考文献54-58
• 致谢58

【共引文献】

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本文编号：1075234