miR-182在耳蜗前体细胞增殖和分化中的作用及机制研究

发布时间：2017-10-21 19:19

  本文关键词：miR-182在耳蜗前体细胞增殖和分化中的作用及机制研究

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【摘要】：成年哺乳动物毛细胞缺乏自发再生的能力，所以随着时间推移，受年龄、疾病、外伤等因素的损伤，毛细胞数量会逐渐减少，当减少到一定程度后，就会出现听力下降，导致感音神经性耳聋。近年来，利用干细胞（stem cells）进行替代治疗成为毛细胞再生的研究热点。 耳蜗前体细胞（Cochlear progenitor cells，CPCs）是指胚胎和新生哺乳动物耳蜗中存在的具有干细胞特点的细胞，在体外具有自我更新能力，可传代培养，诱导分化后可表达毛细胞或支持细胞特异性标志物，其中毛细胞样细胞具有毛细胞纤毛样结构。与神经干细胞（NSCs）相比较，耳蜗前体细胞在毛细胞再生研究方面具有很大的优势：首先，耳蜗前体细胞更容易分化成为毛细胞样细胞；其次，耳蜗前体细胞分化为毛细胞标志物阳性的细胞比例更高，达10%以上。因此，耳蜗前体细胞是目前替代损伤耳蜗毛细胞的最佳候选细胞。 microRNA （miRNA）是一类非编码小分子RNA，具有高度的保守性，广泛存在于哺乳动物基因组中，调控着超过半数脊椎动物mRNA的表达。研究发现miRNA183家族（包括miR-182/96/183）在出生后小鼠的内耳毛细胞中特异性表达，并在毛细胞的分化过程中高表达。其中，miR-182在具有增殖能力的耳蜗前体细胞（CPCs）中水平较高，而在细胞分化的过程中miR-182表达逐渐下降，且miR-182的表达水平在未分化的NSCs中显著低于CPCs。我们认为miR-182可能同时参与耳蜗毛细胞的增殖及分化调控，具有促进耳蜗毛细胞再生的潜能。 实验一大鼠耳蜗前体细胞的分离培养、鉴定及体外诱导分化模型的建立 目的成年哺乳动物耳蜗毛细胞一旦损伤后不能自发再生，这是导致感应神经性耳聋的主要原因。通过对耳蜗毛细胞分化、调控机制的研究，也许可以帮我们找到毛细胞再生的新途径。目前还没有建立起能稳定传代的毛细胞细胞系及前体细胞细胞系。我们建立了耳蜗前体细胞体外分离、培养的体系，并在体外成功诱导分化产生毛细胞样细胞，为研究毛细胞再生提供了切实可行的细胞模型。 方法从新生大鼠耳蜗中分离培养耳蜗前体细胞，进行原代培养，并用血清诱导分化。BrdU、Nestin免疫荧光染色鉴定细胞自我增殖能力；myosin Ⅶa和phalloidin免疫荧光染色鉴定其分化为毛细胞的潜能。 结果耳蜗前体细胞体外培养，第二天即形成大量细胞球，，悬浮生长。收集悬浮的细胞球行免疫荧光染色，细胞球内大量细胞BrdU、Nestin阳性。体外诱导耳蜗前体细胞分化，分化细胞表达myosin Ⅶa、phalloidin等毛细胞标志物，在电镜下可见细胞表面有纤毛样结构。 结论本研究证实在新生大鼠耳蜗内存在具有增殖、分化能力的耳蜗前体细胞，这种前体细胞可以体外培养，并可诱导分化产生毛细胞样细胞。提示我们所建立的这个细胞培养体系可以用来研究毛细胞的功能，也可以用来研究毛细胞的再生。 实验二miR-182在耳蜗前体细胞增殖中的作用及其可能机制 目的黑任轶等[39]在实验中观察到miR-182在耳蜗前体细胞未分化阶段出现表达量的峰值，随后其表达量随着细胞的分化进行而逐渐下降。为进一步研究miR-182对前体细胞增殖期的作用及其机制，我们应用过表达及基因沉默技术，向前体细胞内转染miR-182的模拟物（mimics）及inhibitor，观察miR-182过表达及低表达后对耳蜗前体细胞增殖凋亡的影响，并检测细胞中部分相关基因蛋白表达量的变化。 方法从新生大鼠耳蜗中分离培养耳蜗前体细胞，进行增殖培养。分别利用miR-182mimics和inhibitor在新生大鼠耳蜗前体细胞中过表达和低表达miR-182，然后继续增殖培养4天后，用流式细胞仪检测各组耳蜗前体细胞的细胞周期及凋亡，用RT-PCR、Western-blot检测部分基因及蛋白的变化。 结果使用miR-182mimics进行过表达后，耳蜗前体细胞中P27kip1、FoxO1、FoxO3表达量增加，细胞增殖能力减弱。使用inhibitor进行低表达，结果相反。 结论过表达miR-182可以抑制耳蜗前体细胞增殖，P27kip1、FoxO1、FoxO3等可能是其间接靶基因。外源性miR-182mimics可以抑制耳蜗前体细胞的增殖，在耳蜗前体细胞未分化阶段miR-182出现表达量的峰值，其作用可能是为了限制耳蜗前体细胞的增殖能力，防止细胞的过度增加。 实验三miR-182在耳蜗前体细胞分化中的作用及其可能机制 目的探讨miR-182诱导耳蜗前体细胞向毛细胞分化的作用及机制。 方法从新生大鼠耳蜗中分离培养耳蜗前体细胞并用分组血清诱导分化，分别利用miR-182mimics和inhibitor在新生大鼠耳蜗前体细胞中过表达和低表达miR-182，然后细胞诱导分化7天后，用流式细胞仪检测分化细胞中myosinⅦa阳性细胞比例，用Western-blot检测相关分子Sox2、Hes1、p27kip1、math1的变化。 结果使用miR-182mimics进行过表达后，耳蜗前体细胞分化为myosinⅦa阳性表达的细胞比例高于对照组，使用miR-182inhibitor进行低表达后此比例低于对照组。Western-blot检测显示Sox2、Hes1、p27kip1在miR-182mimics组较对照组降低，miR-182inhibitor组较对照组增加。math1在miRNA182mimics组增高，在inhibitor组减少。 结论过表达miRN182可以促进耳蜗前体细胞向毛细胞方向分化，Sox2、Hes1可能是此过程中的靶基因。外源性的miR-182可以促进耳蜗前体细胞向毛细胞样细胞分化，高表达或者沉默miR-182，可以使Sox2、Hes1、p27kip1、math1等发生变化，与我们的预测结果一致。但是，miR-182是否通过调控Sox2、Hes1、p27kip1、math1等来调控毛细胞的分化，其机制还有待进一步研究。
【关键词】：耳蜗前体细胞 原代培养 分化 毛细胞 miR-182
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R764.431
【目录】：

• 缩略语表4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 前言12-13
• 文献回顾13-22
• 耳蜗毛细胞再生的研究进展13-19
• MicroRNA183 家族与耳蜗发育相关研究进展19-22
• 实验一 大鼠耳蜗前体细胞的分离培养、鉴定及体外诱导分化模型的建立22-33
• 前言22-23
• 1 材料23-24
• 2 方法24-28
• 3 结果28-31
• 4 讨论31-33
• 实验二 miR-182 在耳蜗前体细胞增殖中的作用及其可能机制33-57
• 前言33-34
• 1 材料34-35
• 2 方法35-42
• 3 结果42-51
• 4 讨论51-57
• 实验三 miR-182 在耳蜗前体细胞增殖中的作用及其可能机制57-69
• 前言57
• 1 材料57-59
• 2 方法59-60
• 3 结果60-66
• 4 讨论66-69
• 小结69-70
• 参考文献70-76
• 个人简历和研究成果76-77
• 致谢77

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 钟翠萍;马东洋;韩宇;徐学海;马敬;朱友平;邱建华;陈阳;;新生大鼠耳蜗前体细胞的培养及鉴定[J];中华耳科学杂志;2011年02期

2 李华伟;内耳毛细胞再生前体细胞的来源、激活及调节因素[J];听力学及言语疾病杂志;1998年01期

中国博士学位论文全文数据库 前2条

1 黑任轶;microRNA在耳蜗前体细胞增殖和分化中的作用探讨[D];第四军医大学;2011年

2 钟翠萍;c-Myc及CyclinA2基因诱导大鼠耳蜗前体细胞增殖的体外研究[D];第四军医大学;2010年

本文编号：1074883