维甲酸诱导内耳祖代细胞分化的研究

发布时间：2017-10-30 04:07

  本文关键词：维甲酸诱导内耳祖代细胞分化的研究

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【摘要】：目的：观察体外无血清培养基条件下维甲酸（RA）能否诱导内耳祖代细胞分化为毛细胞。 方法：取冻存内耳祖代细胞（CNPs）解冻后在25cm2的培养板中用DMEM/F12+N2+EGF+bFGF无血清培养基条件下培养3天，取生长状态良好的细胞在倒置显微镜下观察细胞形态特点。选择生长状态良好的细胞，用细胞免疫化学方法检测神经干细胞标志蛋白（Nestin）的表达，进一步鉴定细胞的分化情况。 实验分为实验组和对照组。内耳祖代细胞爬片后用培养液诱导分化，培养液每天更换。诱导培养3天后收集细胞进一步检测。实验组分别进行如下实验：①用DMEM/F12+RA（10-6M）培养液进行诱导。②用细胞免疫荧光方法检测毛细胞标志物Math1、MyosinⅦa蛋白的表达；③提取诱导后的内耳祖代细胞的RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性；RT-PCR进行基因扩增，然后进一步用琼脂糖凝胶电泳检测毛细胞标志物基因的表达情况；④用Brdu荧光染色法检测细胞增殖，并用鬼笔环肽检测细胞骨架F-actin的表达情况。对照组细胞用DMEM/F12+DMSO(0.11mg/ml）培养液诱导。 结果： 1.内耳祖代细胞（CNPs）均可见到Nestin的表达。 2.细胞免疫荧光法显示实验组和对照组均可见荧光，实验组和对照组Math1+、MyosinⅦa+细胞率分别是63%,1.5%;56%,0.96%。 3.RT-PCR电泳结果显示实验组和对照组毛细胞标志物基因均有表达，但实验组的电泳条带较对照组明显。 4.细胞增殖实验检测显示Brdu+细胞率RA组(20.6%)小于阴性对照(29.9%)组和阳性对照组(54.3%)，，阴性对照组和阳性对照组之间有差异。 5.F-actin细胞免疫荧光法对照组的细胞纤维方向相对一致，对照组纤维方向较乱，但荧光强度显示ctrl组，处理3天的对照组与实验组的差别没有统计学意义，分别为21.60,22.60,24.50。 结论： 1.内耳祖代细胞（CNPs）在无血清条件下生长良好，但未观察到明显分化现象，保持了神经干细胞的特性。 2.经RA诱导培养的内耳祖代细胞毛细胞标志物Math1、MyosinⅦa明显增高，推测RA可能促使内耳祖代细胞分化为毛细胞。 3.RA体外抑制了内耳祖代细胞增殖；RA促进内耳祖代细胞细胞骨架F-actin重新分布，但并未促进细胞骨架F-actin的形成。
【关键词】：内耳祖代细胞 Math1 MyosinⅦa RA F-actin
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R764.431
【目录】：

• 主要缩略词及中英文对照4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-11
• 1 内耳祖代细胞的培养11-16
• 1.1 实验材料11-12
• 1.2 CNPs 的培养和传代12-13
• 1.3 神经干细胞的特异性标志物 nestin 在内耳祖代细胞中的表达13-14
• 1.4 实验结果14-15
• 附图15-16
• 2 在体外 RA 诱导内耳祖代细胞分化为毛细胞的研究16-26
• 2.1 实验材料16-17
• 2.2 CNPs 细胞的诱导17
• 2.3 诱导后 CNPs 细胞 Math1、Myosin7a 细胞免疫荧光检测17-18
• 2.4 RT-PCR 检测诱导后细胞 Math1、Myosin7a 的 mRNA 表达情况18-20
• 2.5 统计学分析20
• 2.6 实验结果20-22
• 附图22-26
• 3 在体外 RA 对内耳祖代细胞细胞骨架 F-actin 的影响26-33
• 3.1 实验材料26-27
• 3.2 细胞增殖——Brdu 实验27-28
• 3.3 RA 对内耳祖代细胞细胞骨架 F-actin 的影响28-29
• 3.4 统计学分析29
• 3.5 实验结果29-30
• Brdu 检测细胞增殖29
• RA 对内耳祖代细胞细胞骨架 F-actin 的影响29
• 结论29-30
• 附图30-33
• 讨论33-38
• 1.内耳祖代的特点和优势33
• 2.毛细胞的特征性标志物和诱导毛细胞分化的相关因子33-35
• 3.内耳祖代细胞经诱导能分化为毛细胞35-37
• 4.抑制内耳祖代细胞增殖能促进其分化37
• 5.维甲酸对 f-actin 的作用37-38
• 结论38-39
• 参考文献39-43
• 致谢43-44
• 综述44-55
• 参考文献51-55

本文编号：1116021