蛋氨酸对顺铂引起的内耳毒性保护机制的研究

发布时间：2017-10-30 10:37

  本文关键词：蛋氨酸对顺铂引起的内耳毒性保护机制的研究

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【摘要】：目的：顺铂是在临床当中广泛应用的化疗药物，主要用于卵巢癌、睾丸癌、肺癌、头颈部肿瘤和膀胱癌。虽然其抗肿瘤的疗效可以肯定，但是它的副作用在治疗的过程中和治疗后发生，这些副作用包括消化道反应、肾毒性、神经毒性和耳毒性。听力损伤的主要特点是双侧进行性、不可逆性的，往往累及的是高频听力，严重时可以累及中低频听力。目前的研究大多集中在顺铂的听力损伤方面，但顺铂导致的前庭功能紊乱同样不能忽视，前庭功能的紊乱可直接引起患者眩晕并丧失行动能力，这样就严重影响了许多肿瘤病人康复后的生存质量。 顺铂导致内耳毒性的机制目前尚未完全阐明，其对耳蜗形态的影响主要表现在Corti器的外毛细胞、血管纹和螺旋神经节三方面，而前庭组织的形态学暂时还没有充分的报道可供参考。活性氧簇（ROS）在顺铂内耳毒性中所起的作用得到广泛认可。ROS积聚后产生的亚硝酸盐可以破坏蛋白质的结构和功能；ROS还作用于构成细胞膜的多不饱和脂肪酸，使之变性生成具有更强毒性的4-羟基壬烯醛（4-HNE），4-HNE与Ca2+内流密切相关，而Ca2+内流可直接导致细胞凋亡的发生。此外，耳蜗中存在大量缝隙连接蛋白，即Connexin26（Cx26）和Connexin30（Cx30），对于正常的听力是必不可少的，Cx26和Cx30因在遗传性耳聋中的作用而被广泛关注，但两种蛋白是否参与了顺铂导致的耳毒性和前庭毒性的发病机制,国内外目前还没有相关研究。在预防耳毒性上，蛋氨酸可以减少顺铂导致的听功能损伤和耳蜗毛细胞的丢失，是一种很好的内耳保护药物。 我们将通过动物实验来研究蛋氨酸在功能学、形态学、氧化应激水平和凋亡水平上对顺铂引起的内耳毒性是否均具有保护作用，以及连接蛋白Cx26和Cx30是否参与了顺铂导致的耳毒性和前庭毒性，蛋氨酸能否对Cx26和Cx30在顺铂中的变化产生影响。 方法：30只雄性昆明小鼠按照随机原则分为①对照组（n=10）②顺铂组（n=10）③蛋氨酸+顺铂组（n=10）。①对照组：腹腔注射生理盐水2ml，1次/天，连续3天；②顺铂组：腹腔注射顺铂溶液15mg/kg体重，1次/天，连续3天；③蛋氨酸+顺铂组：首先腹腔注射蛋氨酸溶液400mg/kg体重，一个小时后，腹腔注射顺铂溶液15mg/kg体重，1次/天，连续3天。三组昆明小鼠在造模前和造模后，都接受听觉脑干反应（ABR）和前庭诱发肌电位（VEMP）的测试来评估听力功能和前庭功能，依据不同的实验要求来收集基底膜组织和前庭组织的标本。通过基底膜及前庭组织铺片HE染色和myosin-VI染色来观察各组毛细胞的存活情况；通过脂质过氧化产物4-HNE免疫组织化学和TUNEL凋亡检测来研究各组内耳中的氧化应激水平和凋亡情况；通过Cx26和Cx30免疫荧光组织化学染色及Cx26和Cx30western blot检测来观察两种蛋白在各组中的表达，从而研究蛋氨酸是否在上述方面对顺铂引起的耳毒性和前庭毒性具有保护作用。利用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，结果以均数±标准差形式表示，以P0.05为存在显著性差异的检验标准。 结果： 1一般观察结果：对照组小鼠正常生长,好动，耳廓反应灵敏；顺铂组小鼠毛发无光泽，消瘦，不好动，，耳廓反应不灵敏；蛋氨酸+顺铂组小鼠正常生长，毛发有光泽，略消瘦，好动，耳廓反应较灵敏。 2听觉脑干反应（ABR）测试结果：实验前各组实验动物ABR阈值、潜伏期及波间期没有统计学差异；试验后对照组小鼠阈值为（3.25±3.35）dB SPL，顺铂组小鼠阈值为（63.10±19.87）dB SPL，蛋氨酸+顺铂组小鼠阈值为（41.67±13.17）dB SPL，三组之间两两比较均存在统计学差异（P0.05）。 3前庭诱发肌电位（VEMP）测试结果：造模前三组小鼠VEMP检测均引出正常的波形，且各组间Ⅰ波、II波潜伏期没有统计学差异（P0.05）。造模后，正常组小鼠可以引出正常波形，Ⅰ波、II波潜伏期分别为（0.57±0.12）ms和（0.89±0.13）ms；顺铂组小鼠均未引出正常的波形；蛋氨酸+顺铂组小鼠可以引出波形，但Ⅰ波、II波潜伏期分别是（1.60±0.54）ms和（1.98±0.53）ms，与对照组相比Ⅰ波、II波潜伏期存在统计学差异（P0.05）。 4基底膜及前庭组织铺片HE染色和myosin-VI染色结果：对照组实验动物耳蜗内、外毛细胞排列整齐，结构清晰，未发现变性、缺损；顺铂组实验动物与对照组相比，毛细胞出现较为明显的缺失，以外毛细胞更为明显；蛋氨酸+顺铂组实验动物与对照组相比，毛细胞出现散在的缺失，主要出现在外毛细胞，剩余毛细胞结构较为完整。 54-HNE免疫组织化学染色结果：对照组耳蜗组织切片中耳蜗基底膜、血管纹、螺旋侧韧带和球囊中没有表达4-HNE；顺铂组耳蜗基底膜、血管纹、螺旋侧韧带和球囊中都非常强烈地表达了4-HNE；蛋氨酸+顺铂组耳蜗基底膜、血管纹、螺旋侧韧带中出现了4-HNE的表达，但明显弱于顺铂组，球囊中几乎没有4-HNE的表达。 6TUNEL凋亡检测结果：对照组实验动物耳蜗组织切片TUNEL染色没有发现凋亡细胞的出现，球囊中同样没有发现凋亡细胞；顺铂组在耳蜗组织基底膜、血管纹和螺旋侧韧带上出现较多的凋亡细胞，球囊中散在出现了凋亡细胞；蛋氨酸+顺铂组在耳蜗组织基底膜、血管纹和螺旋侧韧带上局部出现散在的凋亡细胞，但凋亡细胞的数量要明显少于顺铂组，球囊则没有发现明显的凋亡细胞。 7Cx26和Cx30免疫荧光组织化学染色结果：对照组耳蜗组织切片中，耳蜗组织基底膜、血管纹和螺旋侧韧带上存在大量的Cx26和Cx30蛋白，球囊中同样存在大量的Cx26和Cx30蛋白；顺铂组耳蜗组织基底膜、血管纹、螺旋侧韧带以及球囊上Cx26和Cx30蛋白出现了明显的减少；蛋氨酸+顺铂组耳蜗组织和球囊中的Cx26和Cx30蛋白要多于顺铂组，但较对照组还是出现了一定程度的下降。 8Cx26和Cx30western blot检测结果：顺铂组中Cx26和Cx30的表达要明显弱于对照组和蛋氨酸+顺铂组，即两种蛋白在顺铂组中出现了明显的下降，而对照组和蛋氨酸+顺铂组相比，Cx26和Cx30的表达没有统计学差异。 结论： 1顺铂可以导致听觉功能和前庭功能的损伤，并且形态学中出现与之相对应的毛细胞的损伤和破坏，蛋氨酸对上述功能学和形态学的破坏具有一定的保护作用。 2顺铂通过ROS和细胞凋亡导致耳毒性和前庭毒性的出现，而蛋氨酸在ROS和细胞凋亡水平上对其具有一定的保护作用。 3连接蛋白Cx26和Cx30可能参与了顺铂内耳毒性的发病机制，而蛋氨酸能够阻止Cx26和Cx30在顺铂应用过程中的下降。
【关键词】：顺铂 内耳毒性 氧化应激 凋亡 连接蛋白26 连接蛋白30 蛋氨酸
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R764.3
【目录】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-12
• 前言12-13
• 材料与方法13-19
• 结果19-23
• 附图23-40
• 附表40-45
• 讨论45-49
• 结论49
• 参考文献49-53
• 综述 药物性耳聋及防治措施的研究进展53-62
• 参考文献57-62
• 致谢62-63
• 个人简历63

【参考文献】

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本文编号：1117310