喉黏膜慢性炎症组织来源的间充质干细胞的生物学行为观察

发布时间：2017-10-30 19:42

  本文关键词：喉黏膜慢性炎症组织来源的间充质干细胞的生物学行为观察

  更多相关文章： 声带疤痕 喉黏膜间充质干细胞 炎症微环境 增殖 成骨分化 成脂分化

【摘要】：声带外伤、感染等均可使声带固有层受到损害，影响发声。如何预防和减少声带萎缩及声带在修复过程中疤痕的形成就成为了我们迫切需要改善并解决的一个重要问题。 人体组织内成体干细胞的动态平衡及分化是组织器官再生修复的生物学基础。人喉黏膜固有层中也存在着具有良好的自我更新能力及多向诱导潜能的细胞，我们称其为喉黏膜间充质干细胞（laryngeal mucosa mesenchymal stem cell，LM-MSCs）。我们设想将LM-MSCs植入受损声带，实现原位干细胞移植，来进行声带损伤的修复，是否会为声带损伤的患者带来新的希望呢？因此本实验组前期研究通过在声带损伤处植入荧光标记的LM-MSCs，观察其在声带内的存活、转归以及对声带损伤的修复情况。结果发现LM-MSCs在受损的声带固有层中存活时间长达8周以上，植入的细胞数量随时间推移逐渐减少。有少数LM-MSCs在声带固有层内转化为成纤维细胞和肌成纤维细胞，参与了声带的损伤修复。实验结果显示LM-MSCs可在一定程度上减轻声带的损伤。众所周知，炎症环境下机体自身难以完成疾病组织的自我再生修复，因而声带局部炎症环境下，声带固有层细胞的存活能力、细胞外基质成分的改变是否影响着声带损伤的修复呢？因此本实验利用正常（下咽癌患者全喉切除手术，无病变一侧的正常声带标本）及炎症（声带息肉手术的标本）喉黏膜组织，观察LM-MSCs在正常及局部炎症组织中的表达和分布以及组织固有层细胞外基质成分的改变。并检测通过有限稀释法获取的正常及炎症来源的LM-MSCs在体外的增殖活性、扩增效应、克隆形成能力、多向分化能力等，比较正常和炎症组织来源LM-MSCs生物学特性，明确炎症微环境对LM-MSCs生物学特性的影响。为进一步揭示炎症对LM-MSCs功能影响的分子机制及利用LM-MSCs解决声带组织缺损再生修复问题提供理论基础。 研究目的： 分析比较正常及炎症喉黏膜组织固有层细胞外基质成分的差异，观察LM-MSCs在正常及炎症喉黏膜组织中的表达和分布，并通过对正常及炎症来源的LM-MSCs（H-LM-MSCs和I-LM-MSCs）的鉴定及比较两种LM-MSCs的增殖、分化能力，研究I-LM-MSCs的生物学特性，并探讨炎症微环境对LM-MSCs生物学行为的影响。 研究方法： 1.取正常及炎症声带组织，组织块石蜡包埋固定、切片。利用HE染色观察正常及炎症声带组织的大体结构及炎症浸润后组织结构的变化。并且通过Masson trichrome染色及Elastin VG染色分别观察组织固有层细胞外基质胶原纤维及弹力纤维的含量变化。 2.组织石蜡切片，通过免疫组织化学染色及免疫荧光化学染色法检测正常及慢性炎症声带组织固有层中干细胞表面标志物STRO-1的表达及分布。 3.利用组织消化、有限稀释法获取H-LM-MSCs和I-LM-MSCs，免疫细胞化学技术和流式细胞术检测H-LM-MSCs和I-LM-MSCs的干细胞标志分子的表达。 4.通过MTT、克隆形成率计算及流式细胞仪检测H-LM-MSCs和I-LM-MSCs的细胞周期及凋亡，同时比较两种细胞的增殖能力。 5.将H-LM-MSCs和I-LM-MSCs分别进行成骨、成脂诱导。通过茜素红染色、Ca~(2+)定量、ALP染色比较不同来源LM-MSCs的成骨分化能力；通过油红O染色，比较H-LM-MSCs和I-LM-MSCs的成脂分化能力。 实验结果： 1.正常声带组织HE染色可见声带组织由浅至深依次为复层鳞状上皮、固有层、肌层，组织结构清楚，细胞外基质排列有序，炎症声带组织HE染色可见鳞状上皮明显增厚，固有层局部可见炎性细胞浸润；细胞外基质成分染色结果显示（通过切片IOD值检测）：正常声带组织固有层细胞外基质排序整齐，Masson trichrome染色可见炎症声带组织固有层胶原纤维增粗且排序紊乱，含量高于正常声带组织，Elastin VG染色可见弹力纤维变细，并且含量低于正常。 2.对干细胞表面标志物STRO-1进行免疫荧光化学染色结果显示：正常及炎症声带组织中均存在STRO-1的表达，，散在分布于组织固有层及肌层，并且两组声带组织中STRO-1阳性表达的数量无明显差异。 3.在炎症声带组织中同样含有喉黏膜间充质干细胞，利用有限稀释法得到的H-LM-MSCs和I-LM-MSCs外观上都呈纺锤形的成纤维细胞样，均具有一定的克隆形成能力，特异性干细胞表面分子标记表达一致。 4.体外有限稀释法单细胞培养的H-LM-MSCs和I-LM-MSCs均表现出自我更新能力；I-LM-MSCs组的克隆形成率高于正常组；MTT细胞生长曲线和流式细胞周期检测结果均显示I-LM-MSCs的增值能力明显高于对照组；细胞凋亡检测结果显示H-LM-MSCs和I-LM-MSCs凋亡率无明显差异。 5.茜素红染色及定量、ALP染色及ALP活性检测结果显示，I-LM-MSCs成骨分化能力明显低于H-LM-MSCs；油红O染色结果显示I-LM-MSCs成脂诱导后形成脂滴量明显少于H-LM-MSCs，说明I-LM-MSCs的成脂分化能力降低。 结论： 1.本实验通过HE染色可见炎症声带组织鳞状上皮增厚，炎性细胞浸润；Massontrichrome染色结果显示炎症声带组织固有层胶原纤维增粗且排序紊乱，含量高于正常声带组织；Elastin VG染色结果显示弹力纤维变细，并且含量低于正常。以上结果表明炎症使声带组织上皮增生，固有层增厚，慢性炎症致使声带组织的胶原含量增加，弹力纤维含量下降，最终导致声带组织瘢痕化加重、粘弹性降低。 2.免疫荧光化学染色结果显示正常及炎症声带组织固有层中散在干细胞表面标志物STRO-1的表达，并且表达量无明显差异，说明声带固有层中确实存在干细胞群体。 3.本实验从正常及炎症声带组织中通过消化法、有限稀释法成功获得H-LM-MSCs和I-LM-MSCs，分离的细胞都具有一定的克隆形成能力，并且表达间充质干细胞表面标志物。说明两种喉黏膜间充质干细胞均表现出干细胞的生物学特性。 4.正常及炎症组织固有层间充质干细胞均表现出自我更新的能力，但I-LM-MSCs的克隆形成率高于H-LM-MSCs，且MTT生长曲线和流式细胞周期的结果均显示I-LM-MSCs的增殖高于H-LM-MSCs。以上结果均说明慢性炎症可促进组织内细胞增殖。 5.正常及炎症组织固有层间充质干细胞均有明显的成骨、成脂分化潜能，I-LM-MSCs的成骨、成脂能力弱于H-LM-MSCs。说明炎症微环境下LM-MSCs的分化能力降低。
【关键词】：声带疤痕 喉黏膜间充质干细胞 炎症微环境 增殖 成骨分化 成脂分化
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R767.4
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-11
• Abstract11-16
• 前言16-18
• 文献回顾18-22
• 一、声带损伤的治疗18-19
• 二、喉黏膜干细胞与声带损伤修复19-20
• 三、炎症微环境与干细胞20-22
• 实验一 正常及炎症来源的声带组织固有层细胞外基质成分的比较22-30
• 1 材料22-23
• 2 实验方法23-26
• 3 实验结果26-29
• 4 讨论29-30
• 实验二 STRO-1 在正常及炎症声带组织中的表达及分布30-36
• 1 材料30-31
• 2 实验方法31-33
• 3 实验结果33-35
• 4 讨论35-36
• 实验三 正常及炎症来源的声带间充质干细胞的分离、培养和鉴定36-45
• 1 实验材料36-37
• 2 实验方法37-39
• 3 实验结果39-43
• 4 讨论43-45
• 实验四 正常及炎症来源的声带间充质干细胞增殖及凋亡能力的比较45-50
• 1 实验材料45-46
• 2 实验方法46-47
• 3 实验结果47-49
• 4 讨论49-50
• 实验五 正常及炎症来源的声带间充质干细胞分化能力的比较50-58
• 1 实验材料50-51
• 2 实验方法51-53
• 3 实验结果53-56
• 4 讨论56-58
• 小结58-59
• 参考文献59-65
• 个人简历和研究成果65-66
• 致谢66

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 韩鹏;梁媛媛;赵昱;刘阳;杨润琴;邓志宏;;犬声带激光损伤模型的建立及意义[J];听力学及言语疾病杂志;2012年02期

2 刘阳;韩鹏;梁媛媛;邓志宏;;不同部位喉黏膜间充质细胞的分离培养[J];现代生物医学进展;2011年08期

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 韩鹏;喉黏膜间充质干细胞在声带急性损伤修复中作用的实验研究[D];第四军医大学;2012年

2 刘阳;喉黏膜间充质干细胞的分离培养及鉴定[D];第四军医大学;2011年

本文编号：1119066