盐酸椒苯酮胺对庆大霉素致豚鼠耳蜗毛细胞及螺旋神经节细胞损伤的保护作用研究

发布时间：2017-11-04 13:19

  本文关键词：盐酸椒苯酮胺对庆大霉素致豚鼠耳蜗毛细胞及螺旋神经节细胞损伤的保护作用研究

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【摘要】：研究背景 听力障碍是耳鼻喉科常见疾病,据2013年世界卫生组织报道,全世界有3.6亿人遭受残疾性听力损失困扰,占全球人口的5.3%,其中三分之二在发展中国家。中国是世界上最大的发展中国家,听力障碍残疾人有2057万,占全国人口的16.79‰,为各类残疾之首,其严重影响公众身体健康和生活质量。因此,能否找到有效的方法预防和治疗听力损伤是我们目前面临的巨大挑战。 听力障碍包括传导性耳聋、感音神经性耳聋及混合性耳聋,绝大部分患者为感音神经性聋。目前认为其发病原因有,缺血、药物耳毒性、遗传、老年性、噪声性、病毒感染、自身免疫疾病、听神经病、中枢疾病、肿瘤等。感音神经性聋是内耳及其神经传导通路一系列病变所致听力损失的总称,病理改变主要是毛细胞、螺旋神经节、突触复合体、耳蜗神经及听中枢等器质性改变。 内耳包含两种类型的感受器细胞：内毛细胞(inner hair cell,IHC)和外毛细胞(outer hair cell,OHC),可将机械能转换为生物电能(细胞感受器电位),螺旋神经节细胞是传入神经元,将感受器电位激发形成的神经动作电位传入中枢,形成听觉或位置觉。内、外毛细胞与螺旋神经节的I型、II型传入神经元树突分别形成传入突触。内毛细胞可将不同频率、强度的声音信号转换为电信号,形成电势能,刺激突触前膜释放神经递质到相应的螺旋神经元,再由螺旋神经元投射到中枢神经系统,形成听觉。外毛细胞对声音信号具有放大作用,使耳蜗对声音频率有高度的敏感性和选择性,以辅助内毛细胞。耳蜗内毛细胞传入突触的数量、形态、结构和功能异常会导致感音神经性聋。因此,在声音信号的传递过程中,毛细胞、螺旋神经节等传入神经通路的任何部位损伤都将引起感音神经性聋。耳蜗是高耗能组织,在缺血缺氧时可引起毛细胞坏死、传入神经肿胀导致听力障碍；噪声也可伤害耳蜗毛细胞及传入神经；动物实验中发现,氨基糖苷类抗生素可以导致外毛细胞纤毛损害,甚至外毛细胞本身的损害和死亡,并且也有研究表示其可直接或间接导致螺旋神节细胞凋亡坏死。缺血再灌注、噪声、药物中毒都是感音神经性聋的常见原因,但是有研究指出缺血5min后传入神经肿胀,再灌注后传入神经损伤逐渐恢复至正常；而AmAn的耳毒性呈持续性,即使停药也不能阻止听力损害,更利于我们观察一些预防和治疗措施对耳蜗损伤所起的作用。本实验通过常见的氨基糖苷类抗生素(Aminoglycoside antibiotics,AmAn)--庆大霉素(Gentamicin,GM),建立耳毒性药物致感音神经性聋的动物模型。 AmAn耳毒性发生率高,并且此损伤是不可逆的,在儿童、老人及免疫力低下者中其耳毒性发生率更高。毒性作用使AmAn在临床应用中受到一定程度限制,但是AmAn在治疗严重感染如败血症、泌尿道感染、革兰阴性菌引起的腹内感染,与β-内酰胺类联合治疗心内膜炎等仍有特殊价值；耳科用其鼓室内注射治疗梅尼埃病；目前有研究表明AmAn可抑制HIV复制的活性,这使得AmAn的很多应用不可替代。庆大霉素是由小单饱菌发酵产生的一种杀菌力较强的广谱抗生素,临床应用较广泛,由于其肝肾毒性较其他AmAn,所以是制造感音神经性聋动物模型的理想药物。 庆大霉素进入内耳后主要集中于内耳淋巴液,其产生毒性的靶细胞是毛细胞和螺旋神经节细胞。目前认为GM损伤耳蜗结构主要围绕线粒体损伤,细胞凋亡,氧自由基及钙超载。GM损伤线粒体是通过阻断70S核糖体循环导致蛋白合成障碍,破坏线粒体膜功能,造成线粒体能量供应障碍；线粒体损伤使膜转换电子能力降低,形成大量氧自由基,诱发耳蜗毛细胞内产生大量细胞内活性氧产物(reactive oxygen species,ROS)。氧自由基和钙超载除直接造成细胞损伤外还可以导致细胞的凋亡。有研究指出,细胞凋亡是氨基糖苷类抗生素致聋的主要方式,可通过多条途径实现,但大部分最终都依赖于Caspase-3的活化,Caspase-3是细胞凋亡的执行者。GM在内耳淋巴液中半衰期较长,可被耳蜗毛细胞摄取入胞内,通过上述机制导致细胞凋亡坏死。毛细胞可与螺旋神经节树突构成突触连接,是传入神经的“营养供给站”,其释放神经营养因子和神经递质(谷氨酸等),使神经末梢保持活力,毛细胞被破坏,传入神经及螺旋神经节细胞缺乏营养而发生延迟性死亡。 目前认为在哺乳动物中,毛细胞损伤后再生困难,通过毛细胞再生及耳蜗干细胞移植治疗感音神经性耳聋的方法仍在探索中。传入神经系统损伤是导致感音神经性聋的一个重要病理改变,传入神经系统包括突触复合体、神经末梢及螺旋神经节细胞等,突触结构很容易受外界环境影响导致其功能的异常,螺旋神经节细胞受损后也难以修复。虽有实验表明,传入神经损伤后神经纤维可再生并和毛细胞形成联系；且螺旋神经节细胞死亡后周围的施万细胞增殖,但其不能分化成正常功能的神经元细胞来发挥作用。目前临床上可通过佩戴助听器和人工耳蜗移植来辅助感音神经性聋患者获得部分听力,但是由于习惯势力及经济原因导致其不能广泛使用,大部分患者仍依赖药物治疗。因此,对药物治疗感应神经性聋的探索是耳科研究的重点和难点。 盐酸椒苯酮胺(peperphentonamine hydrochloride, PPTA),是我国自主创新研发的钙增敏剂类强心药及心肌保护剂,已获得3个发明专利,11类化学药品临床试验批件,且已经完成了127例Ⅰ期临床试验。临床前研究表明其不仅具有保护受损心肌、增强心功能并能降低心肌耗氧量的双重作用；还可通过增加SOD活性及GSH含量,减少NO含量,发挥神经保护作用,并且可降低缺血脑组织Caspase-3mRNA的表达,表现出良好的抗凋亡作用。与心脑组织损伤类似,钙超载、自由基、细胞凋亡也是耳蜗损伤的常见原因,PPTA对心脑的保护机制为本研究提供了方向。 本研究第一部分分别建立豚鼠耳蜗缺血再灌注损伤模型及庆大霉素致豚鼠耳毒性动物模型,通过听性脑干反应(ABR)、听毛细胞内琥珀酸脱氢酶的变化,扫描电镜观察两种模型内耳结构的改变,在实验过程中发现庆大霉素致豚鼠耳蜗损伤的动物模型更适合于观察耳蜗损伤；第二部分我们通过建立庆大霉素致豚鼠耳蜗损伤模型以观察PPTA对耳蜗毛细胞及螺旋神经节细胞的保护作用,通过听性脑干反应(ABR)、毛细胞内琥珀酸脱氢酶染色、脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记技术(ternial-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeing,TUNEL)、蛋白质免疫印迹技术(Western blot)、透射电镜等方法检测ABR阈值、Caspase-3蛋白表达、听毛细胞内线粒体功能状态、螺旋神经节细胞凋亡指数及内耳细胞凋亡和坏死等形态学变化,探讨GM的耳毒性机理及PPTA对耳蜗损伤的保护机制,为感音神经性聋药物治疗提供新的实验依据。 本研究分为以下两个部分 第一部分豚鼠耳蜗损伤模型的建立 目的 选择合适的耳蜗损伤模型以便下一步观察PPTA对耳蜗损伤的保护作用。方法 1.1实验动物及分组：健康纯白赤目豚鼠36只,随机分为3组,8只用于实验,4只备用：空白对照组(control group,A组)、缺血再灌注组(I/R group,B组)、庆大霉素组(GM group,C组)。 1.2实验动物模型的建立：A组不做任何处理；B组2%戊巴比妥钠麻醉后,颈前正中逐层切开皮肤及皮下组织,分离出双侧椎动脉和右侧颈总动脉,无创微动脉夹夹住血管,1h后松开再灌注；C组肌肉注射庆大霉素,120mg/kg/d,7d. 1.3实验方法及指标观察：听性脑干反应(auditory brainstem response, ABR)分析造模前及造模后1、7d各组豚鼠听力变化；ABR测量结束后,迅速处死豚鼠,断头取右侧听泡,暴露耳蜗蜗轴,运用基底膜平铺技术,Nachlas氏四唑蓝法显示听毛细胞内琥珀酸脱氢酶(Succinatedehydrogenase, SDH)活性、并辅以扫描电镜观察形态学改变。 结果 1、ABR反应阈：A组各时间点无明显差异(P=0.104,0.05)；B、C组造模后1d、7d与造模前有显著差异(P0.05)；B组在造模7d后有所好转,C组听力呈持续性下降。2、形态学变化：A组听毛细胞琥珀酸脱氢酶着色均匀、无缺失,细胞形态正常。B组：毛细胞排列稍紊乱,着色较均匀；透射电镜下可见外毛细胞纤毛倒伏、缺失,细胞间有裂隙,形态辨别不清。C组部分听毛细胞琥珀酸脱氢酶未着色,电镜下见细胞死亡、形态破坏严重。 结论 缺血再灌注组再灌注后一段时间内听力有所恢复,而庆大霉素对毛细胞呈持续性损害作用,因此庆大霉素致豚鼠耳蜗损伤模型适合于进一步观察PPTA对耳蜗损伤的保护作用。 第二部分盐酸椒苯酮胺对庆大霉素致豚鼠耳蜗毛细胞及螺旋神经节细胞损伤的保护作用研究 目的 研究盐酸椒苯酮胺对庆大霉素致耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞损伤的保护作用。 方法 1.1实验动物及分组：健康纯白赤目豚鼠36只,随机分3组,每组12只：空白对照组(control group)、庆大霉素组(GM group)和盐酸椒苯酮胺组(PPTA group)。 1.2各实验组药物应用：GM组用庆大霉素100mg/kg/d,肌肉注射,14d; PPTA组用庆大霉素致聋并静脉注射PPTA,10mg/kg/d,14d;空白对照组用等量生理盐水肌肉注射。 1.3实验方法及指标观察：听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)分析实验前及实验14d天后听力阈值及Ⅰ波潜伏期变化。实验结束后,迅速断头取双侧听泡,左侧耳蜗用Western blot检测组织中Caspase-3蛋白表达；右侧6只耳蜗用TUNEL染色观察耳蜗细胞凋亡情况,并计算细胞凋亡指数；剩余右侧耳蜗分别观察毛细胞琥珀酸脱氢酶染色及透射电镜观察形态学改变。 结果 1、ABR反应阈：实验结束,正常组、GM组、PPTA组阈值分别为14.58±1.16dB、65.95±1.17dB、36.13±1.17dB,各组间听力阈值变化率有显著差异(P0.05)；Ⅰ波PL分别为1.094±0.028、1.667±0.028、1.254±0.028；各组间听力阈值变化率有显著差异(P0.05)；。2、凋亡指数：螺旋神经节细胞凋亡细胞率分别为0.02±0.00、0.45±0.03、0.16±0.02,各组间有显著差异(P0.05)；3、耳蜗Caspase-3蛋白表达：各组Caspase-3表达分别为1.09±0.11、2.55±0.20、1.67±0.07,各组间有显著差异(P0.05)；4、毛细胞琥珀酸脱氢酶染色：对照组毛细胞着色深,均匀；GM组14d后毛细胞大量死亡；PPTA组部分外毛细胞着色浅,整体颜色浅。TUNEL染色及透射电镜观察：GM组螺旋神经节存在大量凋亡细胞形态,核固缩；神经纤维脱髓鞘改变,PPTA组以上损伤情况较GM组减轻。 结论 PPTA对庆大霉素豚鼠耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞损伤起到保护作用。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R764.4

【参考文献】

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本文编号：1139585