USP22ShRNA慢病毒载体的构建及其干扰人鼻咽癌细胞CNE-2的研究

发布时间：2017-11-19 10:01

  本文关键词：USP22ShRNA慢病毒载体的构建及其干扰人鼻咽癌细胞CNE-2的研究

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【摘要】：目的构建并鉴定USP22ShRNA慢病毒载体，成功感染人鼻咽癌细胞，研究其对人鼻咽癌细胞中USP22基因表达的抑制效率，建立USP22shRNA慢病毒载体稳定干扰细胞系，为进一步研究USP22基因在鼻咽癌中的作用机制奠定基础。 方法针对USP22基因的编码序列设计并合成2条特异性干扰序列，序列两端含有限制性内切酶位点HpaI和XhoI。寡核苷酸链退火生成寡核苷酸双链，5’端磷酸化后将含有酶切位点的寡核苷酸双链克隆到pLL3.7慢病毒表达载体。连接产物经转化、培养，提取其质粒，提取出来的质粒经HpaI和XhoI酶切电泳鉴定，鉴定正确的质粒进行测序。构建成功的慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA与包装载体质粒混匀共转染于293T细胞。通过荧光显微镜下观察GFP情况，对病毒滴度和感染效率进行检测。在适合的感染复数条件下，将包装成功的慢病毒原液感染至人鼻咽癌细胞。通过实时荧光定量RT-PCR及Western blot检测感染前后USP22基因及蛋白表达水平的变化，，得到干扰抑制USP22基因表达的效率。 结果成功构建慢病毒表达载体pLL-USP22-shRNA，通过限制性内切酶HpaI和XhoI酶切电泳和测序鉴定结果正确。慢病毒表达载体与包装载体质粒共转染293T细胞后测定慢病毒滴度为4×107TU/ml，说明病毒转染成功，适合感染目的细胞。在感染复数50的条件下，慢病毒感染至人鼻咽癌细胞CNE-2的感染效率大于95%。通过实时荧光定量RT-PCR及Western blot检测显示转染后CNE-2细胞中USP22基因表达受到抑制，抑制效率为64.03%。 结论应用相关基因工程技术成功构建USP22ShRNA慢病毒载体，并能成功的感染人鼻咽癌细胞CNE-2，很好的抑制了人鼻咽癌细胞CNE-2中USP22基因的表达，建立了USP22shRNA慢病毒载体稳定干扰CNE-2细胞系。为进一步研究USP22基因在人鼻咽癌细胞中的生物学作用奠定了实验基础。
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.63

【参考文献】

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1 熊建军;干丽君;林玲;龚帧;吴周环;李卫东;;泛素特异水解酶22基因RNA干扰真核表达载体的构建及鉴定[J];四川大学学报(医学版);2011年02期

本文编号：1203139