赖氨酸突变对Hsf4b转录活性的调控
本文关键词：赖氨酸突变对Hsf4b转录活性的调控
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【摘要】：背景 先天性白内障是指发生在出生前后的以晶状体浑浊为主要临床症状的一类眼疾病，失明儿童中有22-30%为先天性白内障所致。基因遗传障碍是导致先天性白内障的主要病因，其中以常染色体显性遗传最多。 Hsf4是调控晶状体早期发育的关键因子，应用基因扫描技术发现其DNA结合域错译突变以及发生在内含子和外显子剪接处的终止密码子突变与人和动物家族遗传性白内障的发生密切相关。敲除小鼠Hsf4基因能诱发新生期小鼠白内障。Hsf4主要参与调控新生期晶状体上皮细胞的增生和纤维细胞分化。但是，在晶状体发育过程中，调控Hsf4转录活性的分子机理还不清楚。 Hsf4有Hsf4a和Hsf4b两种亚型，Hsf4b是调节小鼠晶状体发育的唯一亚型。在晶状体组织中，Hsf4b参与上调晶状体热休克蛋白（Hsp25、β-晶体蛋白和γ-晶体蛋白）和晶状体细胞骨架蛋白（P49、vimentin和skap2等）的表达，同时下调FGFs家族成员的表达。这说明Hsf4b对其下游靶基因具有转录激活和转录抑制的双重作用。其双重转录活性受磷酸化调控，磷酸化S299位点可增加Hsf4b类泛素化，抑制Hsf4b的转录活性。我们前期的研究结果显示磷酸化S299位点可增加Hsf4b与Daxx蛋白结合，Daxx可抑制Hsf4b对下游基因Hsp25的表达调控。此外，我们还发现调控晶状体发育的主要生长因子FGF2参与调控Hsf4b蛋白稳定性和转录活性。FGF2通过激活ERK1/2诱导Hsf4b磷酸化和类泛素化从而促进Hsf4b的转录活性。Hsf4b类泛素化主要发生在赖氨酸分子上，赖氨酸也是易被其它修饰如乙酰化和泛素化的氨基酸。在Hsf4b分子中含有多个赖氨酸分子。那么，这些赖氨酸分子在晶状体发育过程中如何被修饰以及它们调控Hsf4b转录活性和蛋白稳定性的机理还不清楚。我们应用GPS蛋白类泛素化和乙酰化分析程序对Hsf4b蛋白序列进行预测，发现有K64、K206、K224、K287、K293、K336、K434位点被修饰的可行性最高。应用定点突变方法对这些位点进行突变，把这些突变体以及野生Hsf4b分别转入Hsf4-/-小鼠晶状体上皮细胞内，然后再测定下游Hsp25和alpha B-crystallin蛋白的表达，结果发现突变后K64G、K206G和K2224G对Hsf4b有抑制作用而K287G、K293G、 K336G和K434G对Hsf4b有激活作用。目前，这些位点调控Hsf4b转录活性的机理正在研究中。 目的 选取不同的赖氨酸位点进行突变之后研究能调控Hsf4b转录活性的赖氨酸及相关信号通路，为早期诊断和治疗与Hsf4b突变相关的先天性白内障提供理论依据。 方法1.设计并合成七对包含突变位点的引物，分别将Hsf4b上的192bp、618bp、672bp、861bp、879bp、1008bp和1302bp位的AAG/AAA突变成GGC。 2.以pWZL-blast-HA-Hsf4b质粒为模板，用包含突变位点的引物进行扩增，获得7个突变质粒。 3.测序正确后，将上述质粒转染进293-phoenix细胞中，用其分泌的含有病毒的上清感染mLEC/Hsf4b-/-细胞，并用药物Blasticidin进行筛选，获得持续且稳定表达突变型Hsf4b的细胞株。 4.用Western blot检测突变后Hsf4b的表达情况，并检测下游蛋白Hsp25和αB-晶体蛋白的表达差异。 5.通过Luciferase assay实验，来验证Hsf4b/K64G和Hsf4b/K293G下游基因αB-晶体蛋白（alpha B-crystallin）的表达差异。 结果 1.成功构建了7个真核表达Hsf4b的突变体质粒。 2.筛选出了持续且稳定表达野生型Hsf4b和突变型Hsf4b的细胞株。 3.突变型Hsf4b蛋白表达量与野生型Hsf4b没有差异。Hsf4b下游蛋白Hsp25和αB-晶体蛋白在mLEC/HA-Hsf4b/K287G、 mLEC/HA-Hsf4b/K293G，mLEC/HA-Hsf4b/K336G和mLEC/HA-Hsf4b/K434G细胞内的表达明显高于其在mLEC/HA-Hsf4b细胞内的表达，而在mLEC/HA-Hsf4b/K64G，，mLEC/HA-Hsf4b/K206G和mLEC/HA-Hsf4b/K224G细胞内的表达则明显低于其在mLEC/HA-Hsf4b细胞内的表达。 4. Luciferase assay实验初步说明了Hsf4b/K64G能明显抑制αB-晶体蛋白（alphaB-crystallin）基因启动子的活性，而Hsf4b/K293G则能激活αB-晶体蛋白（alphaB-crystallin）基因启动子。 结论 翻译后修饰赖氨酸对Hsf4b转录有不同的的调控活性，其中K64、K206和K224位点对Hsf4b转录活性起正调控作用，而K287、K293、K336和K434位点对Hsf4b转录活性起负调控作用。
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R776.1
【共引文献】
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1 陈曦;;6种模式生物热休克蛋白70家族的进化分析[J];安徽农业科学;2011年02期
2 刘泰麟;赵翔;李立新;;蛋白质的品质管理[J];安徽农业科学;2012年04期
3 常蕴华,徐存拴;生物的热休克反应研究进展[J];动物学杂志;2001年03期
4 李建平,张葆欣,王瑞元,叶春;热休克反应对急性运动大鼠心肌自由基代谢的影响[J];北京体育大学学报;2004年02期
5 王凤阳,张学林;热休克蛋白(Hsp72)与运动训练的研究进展[J];北京体育大学学报;2004年04期
6 孔垂辉;徐玉明;;HSP70和肝脏抗氧化能力[J];北京体育大学学报;2007年05期
7 高前进;王二利;王瑞元;;骨骼肌热休克蛋白变化研究进展[J];北京体育大学学报;2007年07期
8 张祥盛,韩玉贞,李冰,张燕,吴淑华,张树华;热休克蛋白在子宫内膜中的表达与不明原因不育症子宫内膜组织学、血清抗精子抗体和性激素水平的相关性研究[J];滨州医学院学报;2002年02期
9 李冰,张祥盛;HSP70与c-fos蛋白在喉癌中表达的相关性[J];滨州医学院学报;2002年03期
10 张淑华;于源华;马玉芹;王玉倩;李忠和;;鱼热激蛋白70的分离纯化[J];长春理工大学学报(自然科学版);2008年04期
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1 邢淑莲;周益林;段霞瑜;邹亚飞;;生物热激蛋白及真菌HSP70的研究进展[A];植保科技创新与病虫防控专业化——中国植物保护学会2011年学术年会论文集[C];2011年
2 李兆群;张帅;王春义;雒s
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