RhoC对喉鳞状细胞癌Hep2细胞的影响

发布时间：2018-01-23 23:52

  本文关键词： 喉鳞状细胞癌 RhoC ALDH1A1 肿瘤干细胞 转移　出处：《中国人民解放军医学院》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的： 通过外源基因导入技术抑制和增强喉鳞状细胞癌细胞-Hep2中RhoC(Ras homology C,Ras同源类似物C)表达，观察肿瘤细胞凋亡、运动、形态学变化及肿瘤干细胞标记物ALDH1A1（Aldehydedehydrogenase1family, member A1乙醛脱氢酶1A1）表达的变化，研究RhoC对喉鳞状细胞癌生物学行为及肿瘤起始细胞群-肿瘤干细胞的影响，为以RhoC为治疗靶点控制喉鳞癌的转移提供实验支持。 方法： （1）通过分子生物学方法设计合成干扰RhoC表达可转录形成RhoC-shRNA（RhoC-short hairpin ribonucleic acid,RhoC短发卡核糖核酸）从而抑制RhoC表达的RhoC-shRNA基因重组质粒GW-shRNA （RhoC-shRNA基因真核表达质粒载体为pENTR/U6-EGFP）和增强RhoC表达的RhoC G14V基因重组质粒13GS03（RhoC G14V基因真核表达质粒载体为pcDNA3.1-EGFP）。（2）运用脂质体转染方法，将重组质粒转染至喉鳞状细胞癌细胞系-Hep2细胞中，并通过转染条件优化，获得最佳细胞转染率。（3） QPCR(Real-time Quantitativepolymerasechainreaction Detecting System,实时定量基因扩增荧光检测系统)技术检测影响RhoC表达后Hep2肿瘤干细胞标志物-ALDH1A1的mRNA(messenger ribonucleic acid,信使RNA)表达。（4）TUNEL法检测影响RhoC表达后Hep2细胞凋亡情况的变化。（5）荧光染色细胞骨架观察影响RhoC表达后，Hep2细胞的形态变化。（6）划痕实验观察影响RhoC表达后Hep2细胞的的运动能力的变化。 结果： （1）通过将两种重组质粒进行基因测序及采用脂质体法转染293T肾上皮细胞系，证实干扰RhoC表达的重组质粒-GW-shRNA和增强RhoC表达的重组质粒-13GS03构建成功。 （2）24孔板培养条件下，抑制RhoC表达的重组质粒GW-shRNA和增强RhoC表达的重组质粒13GS03与脂质体以1.2μｇ质粒与4.2μl脂质体混合形成的转染复合物，Hep2喉鳞癌细胞转染率最高。 （3）抑制Hep2细胞RhoC表达后：肿瘤干细胞标记物ALDH1A1表达显著降低；凋亡增强；细胞形态改变明显，胞体较大，形状近似多边形。 （4）增强Hep2细胞RhoC表达后：肿瘤干细胞标记物ALDH1A1及肿瘤细胞凋亡较未处理Hep2细胞变化不显著；细胞形态变化明显，细胞近似梭形，类似间充质细胞形态，提示细胞运动能力增强。 （5）划痕实验检测细胞运动能力结果显示抑制RhoC表达使喉鳞癌Hep2肿瘤细胞运动能力减低；增强RhoC表达后Hep2肿瘤细胞运动能力增强。 结论： 1、成功构建抑制RhoC表达重组质粒GW-shRNA和增强RhoC表达重组质粒13GS03，为后续研究RhoC在喉鳞癌Hep2细胞中的功能奠定了实验基础。 2、通过QPCR技术检测增强RhoC表达后喉鳞状细胞癌Hep2肿瘤细胞群中肿瘤干细胞标记物ALDH1A1与空白对照组相比无显著变化，但抑制RhoC表达后ALDH1A1显著降低，间接说明了RhoC参与喉鳞癌肿瘤干细胞的形成，，在转移灶起始发生中具有一定的作用。 3、通过改变Hep2细胞中RhoC表达，观察肿瘤细胞的凋亡情况，结果显示增强RhoC表达后细胞肿瘤细胞凋亡现象不明显，与对照组相比无明显变化，抑制RhoC表达肿瘤细胞凋亡增强，说明RhoC具有抑制喉鳞癌肿瘤细胞凋亡的作用，提高了肿瘤细胞在转移扩散中对周围陌生环境的适应能力，使具有活性的肿瘤细胞能够顺利到达转移瘤发生部位。 4、通过改变RhoC表达观察Hep2细胞形态及运动能力的变化，结果显示，增强RhoC表达后喉鳞癌肿瘤细胞运动能力增强，抑制RhoC表达后肿瘤细胞运动能力减弱，说明RhoC对喉鳞癌肿瘤细胞扩散转移具有促进作用。 由此可见，RhoC在喉鳞状细胞癌转移灶形成中发挥着重要作用，以RhoC为治疗靶点具有重要的临床应用价值。
[Abstract]:Objective:
Through the technique of introducing foreign gene inhibition and enhancement of RhoC laryngeal squamous cell carcinoma cell line -Hep2 (Ras homology C Ras homolog C) expression, observe the apoptosis of tumor cells, movement, and the morphological changes of tumor stem cell marker ALDH1A1 (Aldehydedehydrogenase1family member, A1 1A1 expression of aldehyde dehydrogenase), RhoC on the biological behavior of larynx squamous cell carcinoma and tumor initiating cells tumor stem cells, RhoC to provide experimental support for the transfer of control target in the treatment of laryngeal squamous cell carcinoma.
Method锛

本文编号：1458573