失神经骨骼肌纤维化和成肌细胞转分化的分子机制的初步研究

发布时间：2018-02-22 03:05

本文关键词： 失神经 α-SMA TGF-β1 CTGF 肌肉纤维化　出处：《第二军医大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：通过建立c57小鼠副神经损伤的动物模型，研究失神经后肌纤维组织的截面积来了解失神经后的骨骼肌组织纤维化程度，通过纤维化相关因子的表达改变的研究，探讨失神经的胸锁乳突肌的纤维化分子改变规律。再通过离体研究转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGFβ1)诱导成肌干细胞C2C12的纤维化转型，探讨TGFβ1对C2C12细胞纤维化转型的作用及分子机制，以期为临床神经修复时机的选择，临床药物干预提供实验依据和理论依据。方法： 1.失副神经支配的不同时间c57小鼠模型的建立选用健康雄性c57小鼠30只，随机分为六个组，并按术后取材时间不同分为正常组、术后1周、2周、3周、4周、8周组，每组5只。腹腔注射4％水合氯醛(0.5ml／100g)0.3ml，麻醉成功后，分离出右侧胸锁乳突肌并充分暴露出副神经，沿着根部剪除一段长约5mm副神经。分别于术后1周、2周、3周、4周、8周切取胸锁乳突肌。行MASSON染色，显微镜下观察失神经不同时间的肌肉截面积、纤维组织截面积及肌纤维直径。 2.实时定量PCR检测各组肌肉组织中α-平滑肌激动蛋白（α-smooth muscleactin,α-SMA）、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor， CTGF）和TGFβ1mRNA的表达水平。利用Genebank查找出α-SMA、TGFβ1、CTGF及内参的mRNA序列，运用Primer6软件进行引物设计，完成引物合成。通过一系列步骤进行Real-time PCR扩增。利用软件计算出mRNA的值 3.蛋白印迹杂交分析（Western Blot,WB）检测肌肉组织中α-SMA、CTGF和TGFβ1的蛋白表达水平通过制备SDS-PAGE胶、SDS-PAGE电泳、湿转法电转膜、膜的封闭、抗体孵育和显色成像等Western Blot检测步骤检测失神经肌肉组织的纤维化相关因子α-SMA、CTGF和TGFβ1的蛋白表达水平。 4.免疫荧光法检测不同时间失神经肌肉组织α-SMA、CTGF和TGFβ1阳性细胞肌纤维变化冰冻切片通过室温复融、破膜、过夜室温孵育一抗、隔夜后加二抗及染核等步骤进行免疫荧光染色，荧光显微镜下观察图像并采集图像。 5.离体水平研究不同浓度的TGFβ1诱导的C2C12细胞的α-SMA的蛋白表达水平按照不同浓度的TGFβ1（0ng/ml，0.05ng/ml，0.1ng/ml，0.5ng/ml，1ng/ml，2.0ng/ml，5.0ng/ml，10ng/ml）将细胞随机分为8组，每组3个复孔，每孔加入1.5ml含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的细胞培养基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM），待细胞密度生长至70%左右时，每组分别加入相应浓度的TGFβ1，诱导C2C12成肌细胞发生纤维化转型，规定时间收集细胞。检测不同浓度TGFβ1诱导下α-SMA的蛋白表达量的变化，明确TGFβ1诱导成肌细胞发生纤维化转型的最合适浓度。 6.最适浓度TGFβ1诱导成肌细胞纤维化转型中纤维化相关因子的改变以最适浓度的TGFβ1刺激C2C12细胞，刺激时间分别为0、12、24、48小时（hour, h）。在上述规定的时间节点，分别用WB和免疫荧光检测法检测纤维化相关因子的表达改变。结果： 1. c57小鼠失副神经模型建模成功。肉眼观小鼠右侧胸锁乳突肌萎缩明显，随着失神经时间的延长其形态较正常对照明显缩小。通过masson染色切片观察到随着失神经时间的增加，胸锁乳突肌肌纤维逐渐萎缩而致肌纤维平均直径减小，肌肉截面积缩小，而肌间隙胶原结缔组织增多，最终大量占据原肌纤维所在空间。正常对照组与失神经1周组、2周组、3周组、4周组、8周组间比较，差异均有统计学意义（P0.05），说明随着失神经时间的延长，胸锁乳突肌肌纤维出现明显的萎缩及纤维化。而失神经4周后肌肉纤维化趋势减缓，与失神经8周的两组间肌肉截面积、胶原截面积和肌肉直径比较未见明显差异。上述结果说明随失神经时间延长肌肉萎缩纤维化逐渐加重，但失神经4周后萎缩纤维化处于相对稳定的平台期，进展较缓慢。 2.实时定量PCR检测各组组织中α-SMA、CTGF和TGFβ1mRNA的表达结果发现失神经2周后α-SMA和CTGF的转录水平上调最明显，TGFβ1的转录水平在失神经1周后上调。此后各因子转录水平略有下降，但仍有较长时间较高水平的持续表达。 3.正常胸锁乳突肌未见各纤维化相关因子蛋白表达。失神经后1周可检测到α-SMA和CTGF的阳性表达，到失神经2周表达量达到高峰，此后表达量较2周下降，但仍可检测到较高水平阳性条带。TGFβ1的蛋白表达量在失神经1周表达量即明显升高，2周、3周、4周虽有下降，但仍有持续的表达。其结果同PCR结果相一致。 4.免疫荧光法检测失神经组织不同时间α-SMA、CTGF和TGFβ1阳性细胞的结果发现，正常胸锁乳突肌未检测到α-SMA、CTGF及TGFβ1阳性细胞。失神经损伤后1周开始出现α-SMA、CTGF阳性细胞，损伤后2周阳性细胞数目明显最多，表达定位于肌细胞胞浆及胞膜，而TGFβ1失神经后1周表达最强最多，表达定位于肌细胞胞浆及胞膜，而且随着时间的延长，阳性细胞数目减少，但仍维持在一个较高水平。 5.离体实验显示，TGFβ1能诱导C2C12成肌细胞纤维化转型，随着TGFβ1浓度的增高，α-SMA的表达量也逐渐增高，以TGFβ1浓度为5ng/ml时，α-SMA表达最强，但TGFβ1为10ng/ml时α-SMA的表达量则开始下降。提示TGFβ1的最佳诱导成肌细胞纤维化转型的浓度为5ng/ml。以最适合的5ng/ml浓度的TGF-β1干预c2c12细胞后不同时间I型胶原（collagen-I）、CTGF和α-SMA蛋白水平的表达较空白对照组明显增加。collagen-I、CTGF和α-SMA的蛋白表达在12小时即呈高表达状态。并持续稳定表达。 6.免疫荧光法检测可见5.0ng/ml的TGFβ1刺激C2C12细胞12小时后，collagen-I、CTGF和α-SMA3个指标的免疫荧光表达增强，表达定位于细胞膜及细胞浆内，持续到48小时仍无明显减弱。结论： 1.小鼠失神经1-4周的胸锁乳突肌，随失神经时间的延长，肌纤维萎缩纤维化逐渐加重，以4周最为明显。但4周后处于稳定的平台期，纤维化进展缓慢。 2.失神经引起肌纤维的纤维化相关因子持续高表达，而以TGFβ1表达首先达到高峰，而其下游因子CTGF及α-SMA的表达高峰明显迟于TGFβ1。提示失神经后首先激活TGFβ1的表达，通过级联反应，诱使CTGF及纤维化标记物α-SMA的表达，从而产生肌肉失神经萎缩、纤维化。 3.5.0ng/ml的TGFβ1为诱导小鼠成肌干细胞C2C12发生纤维化转型的最适合诱导浓度。离体水平用该浓度刺激C2C12细胞，诱导其纤维化转型，，在0、12、24、48h这几个不同时间点通过WB和免疫荧光观测TGFβ1下游的纤维化效应因子collagen-I、CTGF和α-SMA的蛋白表达和定量表达。结果表明5.0ng/ml的TGFβ1刺激C2C12细胞后，以上3项指标均呈持续高表达状态。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R767.6

【参考文献】