超声微泡介导Rb94基因转染HXO-Rb44细胞的实验研究

发布时间：2018-03-27 12:06

  本文选题：超声　切入点：微泡造影剂　出处：《重庆医科大学》2011年硕士论文

【摘要】：研究目的:本文通过体外实验研究超声爆破微泡造影剂介导Rb94基因对视网膜母细胞瘤细胞转染效率的研究,以及探讨Rb94基因对视网膜母细胞瘤细胞的作用效果。 研究方法: 1.构建增强型绿色荧光蛋白与Rb94基因的真核共表达载体并鉴定其在真核细胞中的表达。 2.微泡携带Rb94基因转染HXO-Rb44细胞与传统脂质体转染方法进行了转染效率的对比。 3.微泡携带Rb94基因转染HXO-Rb44细胞对视网膜母细胞瘤细胞生长活性的影响。 研究结果: 1.重组克隆载体内的目的片段序列与Rb94基因序列完全一致。pEGFP-C1/Rb94酶切鉴定结果与预期结果一致。荧光显微镜下观察可见转染后的细胞有荧光出现。Western blot检测结果表明Rb94基因得到了有效表达。 2.以0.5W/cm2声强,辐照时间30s的连续波,对HXO-Rb44细胞进行Rb94基因的转染,并同传统的脂质体转染法进行了转染效率的比较。空质粒+微泡+超声组、Rb94质粒+微泡+超声组及Rb94质粒+脂质体组的绿色荧光表达明显高于空白对照组、Rb94质粒+微泡及Rb94质粒+超声组。空质粒+微泡+超声组、Rb94质粒+微泡+超声组及Rb94质粒+脂质体组的转染效率明显高于其他各组,且这三组之间的差异不具有统计学意义。RT-PCR检测结果显示:Rb94质粒+超声+微泡与Rb94质粒+脂质体组的RB94mRNA表达明显强于其他各组。Western blot检测结果显示,Rb94质粒+超声+微泡与Rb94质粒+脂质体组的RB94蛋白含量明显高于其他各组。 3.各组细胞的处理方法同前,检测Rb94基因转染后对HXO-Rb44细胞生长活性的影响。Rb94质粒+超声+微泡组与Rb94质粒+脂质体组的MTT值明显小于其余各组。流式细胞仪检测细胞周期结果显示,Rb94质粒+超声+微泡与Rb94质粒+脂质体组G2期细胞随着时间的延长逐渐增多。流式细胞仪检测细胞凋亡率结果显示Rb94质粒+超声+微泡组的细胞凋亡率为28.7%,Rb94质粒+脂质体组的细胞凋亡率为28.6%,明显高于其他各组,两组间的差异不具有统计学意义。 结论 本实验以超声微泡造影剂为基因载体对体外培养的视网膜母细胞瘤细胞进行抑癌基因的转染,探讨了其对视网膜母细胞瘤细胞生长活性的影响,与传统的转染方法作了转染效率的比较,并检测了Rb94基因对视网膜母细胞瘤细胞生长活性的影响。实验结果提示超声微泡作为一种新型的基因转染介质,可达到高效的基因转染目的。Rb94基因对视网膜母细胞瘤细胞的生长具有明显的抑制作用。然而视网膜母细胞瘤的基因治疗尚处于起步阶段,本实验仅为体内实验积累了一定资料,真正应用于临床还需进一步的研究。
[Abstract]:Objective: to investigate the transfection efficiency of Rb94 gene into retinoblastoma cells and the effect of Rb94 gene on retinoblastoma cells in vitro. Research methods:. 1. The eukaryotic coexpression vector of enhanced green fluorescent protein (GFP) and Rb94 gene was constructed and its expression in eukaryotic cells was identified. 2. The transfection efficiency of microbubbles carrying Rb94 gene into HXO-Rb44 cells was compared with that of traditional liposome transfection methods. 3. The effect of Rb94 gene transfection into HXO-Rb44 cells on the growth activity of retinoblastoma cells. Results of the study:. 1. The sequence of the target fragment in the recombinant clone vector was completely consistent with the sequence of Rb94 gene. The result of restriction enzyme digestion of pEGFP-C1 / Rb94 was in agreement with the expected result. The fluorescence appearance of the transfected cells was observed under fluorescence microscope. Western blot analysis showed that Rb94 was detected. The gene was effectively expressed. 2. HXO-Rb44 cells were transfected with Rb94 gene by continuous wave of 0.5W/cm2 intensity and irradiation time for 30s. The transfection efficiency was compared with the traditional liposome transfection method. The green fluorescence expression of Rb94 plasmid microbubble ultrasound group and Rb94 plasmid liposome group was significantly higher than that of the blank control group. The transfection efficiency of abscission plasmid microbubble ultrasound group and Rb94 plasmid liposome group was significantly higher than that of other groups, and the transfection efficiency of Rb94 plasmid microbubble ultrasound group and Rb94 plasmid liposome group was significantly higher than that of other groups. There was no significant difference among the three groups. RT-PCR results showed that the expression of RB94mRNA in the microbubbles and liposomes of Rb94 plasmids was significantly stronger than that in the other groups. Western blot analysis showed that the expression of Rb94 plasmids was significantly higher than that of the other groups. The content of RB94 protein in liposomes of vesicles and Rb94 plasmids was significantly higher than that in other groups. 3. The treatment of cells in each group was the same as before. The effect of Rb94 gene transfection on the growth activity of HXO-Rb44 cells. The MTT value of Rb94 plasmid ultrasound microbubble group and Rb94 plasmid liposome group was significantly lower than that of other groups. Flow cytometry analysis of cell cycle showed that Rb94 plasmid was super. The cell apoptosis rate of Rb94 plasmid ultrasound microbubble group was 28.775% and that of Rb94 plasmid liposome group was 28.775% by flow cytometry. The apoptotic rate of the tumor cells was 28. 6%, which was significantly higher than that of the other groups. The difference between the two groups was not statistically significant. Conclusion. In this study, tumor suppressor gene transfection of retinoblastoma cells was carried out using ultrasound microbubble contrast medium as gene carrier, and the effect of tumor suppressor gene on the growth activity of retinoblastoma cells was investigated. The transfection efficiency was compared with the traditional transfection method, and the effect of Rb94 gene on the growth activity of retinoblastoma cells was detected. Rb94 gene can inhibit the growth of retinoblastoma cells, but the gene therapy of retinoblastoma is still in its infancy. Further research is needed for its application in clinical practice.
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R739.7

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本文编号：1671452