阻塞性睡眠呼吸暂停低通气患者肌纤维类型转换和雌激素相关受体α的作用

发布时间：2018-03-27 21:31

本文选题：阻塞性　切入点：睡眠呼吸暂停　出处：《南方医科大学》2014年博士论文

【摘要】：目的和意义:阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(obstructive sleep apnea hypopnea syndrome,OSAS)人群发病率较高,潜在危害性大,是近年来多个学科的研究热点。但咽腔塌陷详尽的病理生理过程仍未阐明,咽腔解剖异常以及上气道扩张肌功能紊乱是两个最重要的已知致病因素,而不同个体的主导致病因素存在差异。这也是部分患者远期手术疗效不佳的原因。目前,OSAS解剖因素的研究已较为深入,但对于OSAS患者上气道扩张肌特异性肌肉病理改变的研究不多,而肌肉功能紊乱的机制探讨则更少见。肌肉的形态学改变、肌纤维类型、肌球蛋白重链组成成分等可以提供肌肉功能损伤的可靠信息。骨骼肌纤维高度分化,在成体仍具有高度可塑性。为了适应不同的环境条件,肌肉会通过改变其纤维类型的组成来实现其特定的功能特性。而OSAS患者因长期间歇低氧,上气道扩张肌发生适应性病理改变,I型纤维比例下降。同时我们注意到雌激素(estrogen,ER)与女性阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(OSAS)低发病率密切相关,大量流行病学资料已经证实,ER在OSAS发病过程中扮演了保护性角色,但ER引发的分子调控机制一直未明。鉴于雌激素相关受体α(estrogen related receptor-α,ERR-α)主要在高代谢需求的组织中表达,并作为转录因子在肌管的线粒体代谢方面扮演重要角色。因此我们提出假设,ERR-α可能介导OSAS患者上气道扩张肌肌纤维类型转化,进而引发上气道肌力和咽腔塌陷性的变化,在OSAS的发病机制中扮演了重要角色。本课题拟在完善OSAS患者组织标本肌肉病理检查基础上,进行功能基因预测。通过雌激素刺激和ERR-α特异性拮抗逆转的细胞模型,细胞间隙低氧,SiRNA干扰试验,建立去卵巢动物模型,从体内和体外两方面研究ER/ERR-α轴对OSAS患者上气道扩张肌的影响并探讨其分子机制。本项目通过探讨ER/ERR-α轴在OSAS病因中扮演的角色,以新的视角阐述女性OSAS低发病率的机制,为高危女性OSAS患者的预防及激素替代治疗提供理论和实验基础。材料和方法1.临床标本收集选取南方医科大学附属南方医院耳鼻喉科2011年2月至2013年7月的接受外科治疗的成人男性OSAHS患者28例作为研究对象,14例慢性扁桃体炎的非OSAS男性患者作为对照。术中取材,所有标本均为腭咽肌组织,经病理学检查确诊,所有患者既往均无口咽部手术史、无局部放疗史。本研究经南方医院伦理委员会批准,所有患者均签署知情同意书。本研究通过中国临床试验注册中心 Chinese ClinicalTrials.gov 审查批准,批准号 ChiCTR-CCC-13003415,病情分级依据中华医学会阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征诊断和外科治疗指南,根据多导睡眠监测(polysomnography,PSG)结果进行病情判定。2.肌肉病理染色沿肌纤维走行方向将肌肉立于软木塞,用黄蓍胶(tragacanth gum)固定。冰冻连续切片。除了常规苏木精-伊红染色(HE)外,采用3种酶组织化学染色:还原型辅酶 Ⅰ 四氮唑还原酶(nicotinamide adenine dinucleotide-tetrazolium reductase,NADH-TR)染色,改良 Gomori 三色(modified Gomori trichrome,MGT)染色和肌球蛋白三磷酸腺苷酶(ATP酶)染色。3.细胞培养小鼠成肌细胞C2C12采用含10%胎牛血清和1%青链霉素双抗的DMEM高糖培养基,在37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下传代培养,细胞生长状态良好时用于实验。4.细胞间隙低氧培养C2C12细胞置于三气培养箱(Thermo 3111,USA)给予3%间隙低氧培养,直接通入N2精确控制CO2和O2浓度,35min低氧,25min常氧,间隙低氧8h/天。常规培养37℃、5%CO2、饱和湿度的条件做对照。5.细胞ER刺激C2C12细胞中,加入不同浓度的细胞培养用ER,设立空白对照。加入不同浓度的ERR-α特异性拮抗剂XCT-790,确定最佳阻断效果。在不同浓度的ER同时加入最适浓度的ERR-α特异性拮抗剂XCT790,实现ER作用的逆转,证实ER是通过ERR-α实现肌型转化。6.瞬时细胞转染ERR-α的SiRNA瞬时转染:采用阳离子脂质体法进行瞬时转染,操作按LipofectamineTM 2000试剂说明书进行。6孔板中SiRNA的转染量为100nM。7.荧光定量PCR抽提细胞和组织的总RNA,逆转录成cDNA后,18s为内参照,采用SYBR green法进行PCR扩增,通过相对定量以2-△△Ct值代表基因的相对表达强度。8.Western blot抽提细胞总蛋白,采用BCA法进行蛋白浓度测定,然后10%SDS-PAGE电泳、转膜、免疫杂交、显影及定影,蛋白相对表达强度采用Quantity One软件进行定量。9.动物实验取健康雌性SD大鼠假手术组、去卵巢组各5只。麻醉成功后,行双侧卵巢切除手术。假手术组处理方法相同,但只切取腹腔少许脂肪组织。颈正中切口,取两组动物的胸舌骨肌作为自身处理前的对照。2周后,取大鼠胸舌骨肌,组织放入匀浆器中匀浆,qRT-PCR检测组织中各型型MyHC及及ERR-α含量,方法同前。组织切片免疫组化明确蛋白变化。10.免疫组化将石蜡切片进行脱蜡、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、血清封闭、抗体孵育、DAB显色、复染、透明、封片等步骤进行,免疫组化的检测结果进行半定量判定。免疫组化结果判断方法如下:染色强度分数标准:无色为0分,淡黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分。同倍物镜下计数阳性细胞数,1～25%为1分,26～50%为2分,51～75%为3分,75%为4分。两项得分相加,满3分为"+";4分为"++";5分以上为"+++"。"++～+++"为阳性表达。11.统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析。所有独立样本T检验资料,进行组内正态分布性检验(One-SampleKolmogorov-SmirnovTest),组间方差齐性Levene'sTest检验。多组均数比较应用单因素方差分析,多重比较Dunnett检验,其他实验中涉及到两组数据之间的比较均采用两独立样本的t检验,自身前后对照采用配对T检验。两组间病理改变的出现机率使用Pearson Chi-Square卡方检验,当1理论频数5,则采用ContinuityConrrection卡方检验。方差齐性检验以P0.1为临界值,其他以P0.05为差异有统计学意义。结果:1、肌肉病理染色:OSAS患者存在腭咽肌病理损伤,包括肌纤维内部的结构变化和肌纤维类型分布异常,维持上气道开放的Ⅰ型肌纤维比率下降。肌纤维分叶状或虫蚀状改变(χ2值19.091,P=0.0000.05)、不整红边纤维(χ2值3.977,P=0.0460.05)、群组化分布(χ2值 17.348,P=0.0000.05)是 OSAS 患者较为特征性的改变,两组有显著统计学差异。两组都可以观察到核内移的现象,为非特异性改变,但在OSAS组比例较高(χ2值3.938,P=0.0470.05)。仅在部分OSAS患者中观察到,坏死肌纤维、肌内膜和肌束膜增生、靶样纤维,但两组无统计学差异。NADH染色中特征性的环形外观、HE染色中肌纤维大小的明显变异性为两组较为共性的表现。2、OSAS患者腭咽肌肌型分布及ERR-α表达:组织中ERR-α的平均表达仅为正常对照15%。两独立样本T检验,两组间ERR-α△CT值差异具有显著性(16.42±3.06 vsl3.62±4.08,t=-2.495,P=0.070.05)。免疫组化染色证实 ERR-α为细胞核表达,在人骨骼肌中表达丰富。Ⅰ型胞浆表达较深的病例,ERR-α核染色评分也较高。统计学分析显示OSAS患者腭咽肌肌型分布发生改变,Ⅰ型纤维比例减少,而Ⅱx型纤维比例增加。两组Ⅰ、Ⅱx型纤维百分比差异具有显著性(Ⅰ型23.89±24.20vs44.45±16.27,t=3.257,P 值 0.0020.05;Ⅱx 型41.91±21.98vs24.09±10.85,t=-2.799,P 值 0.0080.05)。而两组间 Ⅱa、Ⅱb 型纤维百分比差异无统计学意义。3、分化期ERR-α表达:C2C12细胞分化期ERR-α mRNA的表达较分化前均升高,差异有统计学意义(Welch值17.34,P=0.001)。相比于分化前,MT-1为 2.20±0.64 倍(P=0.0270.05),MT-3 达 2.7l±0.97(P=0.0340.05),MT-5为1.57±0.30倍,(P=0.0260.05),蛋白水平也证实其呈动态改变。4、ERR-αSiRNA的瞬转试验:ERR-αmRNA表达干扰后(0.48倍,T值4.367,P=0.0050.05),明显抑制细胞分化,并且主要是抑制氧化型Ⅰ型纤维的形成(0.31 倍,T 值 11.275,P=0.0010.05),而糖酵解型纤维 Ⅱib(T 值 0.029,P=0.9770.05)表达无抑制。Western blot证实蛋白水平的改变。5、细胞间隙低氧试验:相比于常规培养,3%间隙低氧条件下,C2C12细胞分化受到抑制,肌管形成减少。分化第1天(16.573±1.407vs26.852±3.881,T=4.313,P=0.0130.05)、分化第 3 天(180.14±57.75vs335.72±21.93,T=4.362,P=0.0120.05)、分化第 5 天(341.18 ± 8.97vs484.33 ± 33.39,T=3.582,P=0.0230.05)慢肌纤维Ⅰ基因表达较常规组明显下降,差异具有显著性。3%CIH条件下 ERR-α 在分化第 1 天(1.457±.567vs3.628±.884,T 值 3.582,P=0.0230.05)表达下降,差异有显著性;而各时期快肌纤维表达无改变。6、ER刺激及XCT逆转试验:ER刺激试验表明,不同梯度ER刺激下,ERR-α氧化型慢肌Ⅰ型纤维表达逐步增加,以 10-10M 最为显著(Myhc slow,fold 4.378,P=0.0010.05;ERR-α,fold3.517,P=0.0020.05)。而糖酵解型快肌Ⅱb型纤维总体变化趋势不大。因此E2可促进C2C12细胞分化,主要是通过增加Ⅰ型纤维纤维的表达来实现的。ER+XCT790 逆转试验证明,10-7、10-8、10-9M 的 ER+XCT790 条件下,ERR-α、慢肌Ⅰ型纤维表达均明显下降,以10-7M ER+XCT790条件下最为显著(ERR-αfold 0.26,P=0.000、Myhc slow fold 0.24,P=0.0000.05)。在促进细胞分化作用最显著的10-10ER条件下,加入XCT790,则各基因表达变化并不明显。故ER促进细胞分化的作用可被ERR-α特异性拮抗剂逆转;ER促进细胞分化、增加氧化型Ⅰ型纤维的作用正是通过ERR-α来实现的。7、动物试验:去卵巢组术后2周子宫重量较假手术对照组明显下降(T值6.812,P=0.0000.05),差异具有显著性。SD大鼠自身胸舌骨肌去卵巢手术前后自身对照,qRT-PCR提示去卵巢组手术前后自身ER水平改变可引起ERR-α(1.324±0.596vs0.534±0.710,t 值 5.468,P=0.0320.05)、Myhc slow 慢肌纤维(1.494±0.716vs0.694±0.296,t 值 3.038,P=0.0380.05)表达下降,Myhc fast快肌纤维表达(1.032±0.240vs0.914±0.199,t 值 0.628,P=0.5640.05)无改变。而对照组ERR-α(1.244±.565vs1.294±0.510,t值-0.349,P=0.7450.05)、Myhc slow(1.39±1.28vs1.27±0.94,t值0.909,P=0.4150.05)、快肌纤维(1.298±0.497vs1.37±0.599,t 值-0.952,P=0.3950.05)表达均无差异。免疫组化染色证实蛋白水平变化。结论:1.OSAS患者存在上气道扩张肌重塑,其病理损伤包括肌纤维内部损伤(如肌纤维分叶状或虫蚀状改变、不整红边纤维、群组化分布、坏死肌纤维、肌内膜和肌束膜连接组织增生等),以及肌纤维类型分布异常,Ⅰ型纤维比率下降。2.OSAS患者腭咽肌肌型分布较对照组发生改变,Ⅰ型纤维比例减少,而Ⅱx型纤维比例增加,差异具有显著性;而两组间Ⅱa、Ⅱb型纤维百分比差异无统计学意义。3.ERR-α在OSAS患者腭咽肌中表达下调,组织免疫组化染色进一步证实Ⅰ型胞浆表达较深的病例,ERR-α核染色评分也较高。提示其可能和OSAS患者肌纤维分布变化相关;4.C2C12细胞分化过程中ERR-α呈动态表达,其表达失调影响肌纤维的分化结果,并参与间隙低氧条件下的肌纤维类型转换。5.动物试验、细胞试验均证实ER水平变化可导致肌纤维类型发生转化,并且在细胞水平被ERR-α特异性拮抗剂逆转。6.ERR-α通过调控氧化型慢肌Ⅰ型纤维的表达,改变肌肉的收缩特性、收缩动力学,进而影响OSAS患者上气道扩张肌的功能状态,在其发病进程中扮演重要角色。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R766

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