MITF基因重组真核细胞表达质粒的构建、表达及意义

发布时间：2018-03-31 19:23

  本文选题：Waardengurg综合征　切入点：MITF　出处：《中华耳科学杂志》2014年01期

【摘要】：目的通过构建基因MITF及其突变体表达质粒初步研究其外源性表达和定位表达,为研究Waardenburg综合征(Waardenburg syndrome,WS)发病机制提供一定的实验依据和基础。方法通过分子克隆技术双酶切pCMV-MITF和pCMV-Flag后连接构建MITF基因重组真核细胞表达质粒pCMV-MITF-Flag,以其为模板分别构建MITF基因新发突变R217I和T192fs表达质粒pCMV-R217I-Flag和pCMV-T192fs-Flag,DNA测序鉴定。MITF、R217I和T192fs表达质粒分别瞬时转染NIH3T3细胞或黑色素瘤UACC903细胞,Western blot和细胞免疫荧光分别检测和观察野生MITF蛋白和突变R217I、T192fs蛋白的表达和分布。结果 MITF及其突变体R217I和T192fs表达质粒经DNA测序鉴定序列正确,三者在黑色素瘤UACC903细胞中正确表达,MITF和R217I仅在细胞核中分布,而T192fs仅在细胞质分布。结论成功构建了MITF基因及其突变体真核细胞表达质粒,突变对MITF蛋白的亚细胞定位产生影响,为在体外实验进一步研究国人MITF基因突变致WS发病的分子机制奠定了实验基础。
[Abstract]:Objective to study the exogenous expression and localization expression of MITF gene and its mutant expression plasmid. Methods the recombinant eukaryotic cell expression plasmid pCMV-MITF-Flagar of MITF gene was constructed by double enzyme digestion of pCMV-MITF and pCMV-Flag by molecular cloning technique, which provided a basis for studying the pathogenesis of Waardenburg syndrome.Methods the recombinant eukaryotic cell expression plasmid pCMV-MITF-Flagagwas constructed using molecular cloning technique as the template for the construction of the recombinant eukaryotic cell plasmid pCMV-MITF-Flag. Sequencing of pCMV-R217I-Flag and pCMV-T19fs-Flag#en0# expression plasmids R217I and T192fs expression plasmids of MITF Gene. Transient transfection of NIH3T3 cells or melanoma UACC903 cells with blot and Cellular Immunofluorescence Detection and observation of Wild MITF protein and Mutant R217IT19fs. Results MITF and its mutants R217I and T192fs were sequenced by DNA sequencing. The correct expression of MITF and R217I in melanoma UACC903 cells was found only in the nucleus, but only in the cytoplasm. Conclusion the eukaryotic expression plasmids of MITF gene and its mutant were successfully constructed. The mutation has an effect on the subcellular localization of MITF protein, which provides an experimental basis for further study on the molecular mechanism of WS induced by MITF gene mutation in Chinese in vitro.
【作者单位】： 新疆医科大学第一附属医院耳鼻咽喉科;中南大学医学遗传学国家重点实验室;中南大学湘雅医院耳鼻咽喉科;
【基金】：国家自然科学基金(81260160,81170923)资助
【分类号】：R764

【共引文献】

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本文编号：1692121