大鼠神经母细胞特异性转移因子基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

发布时间：2018-03-31 21:14

  本文选题：干细胞　切入点：腺病毒科　出处：《中国组织工程研究》2015年41期

【摘要】：背景:研究表明,神经母细胞特异性转移因子(ASCL1)是神经发育过程中的关键调控因子,因此通过对成体细胞进行ASCL1基因修饰,有可能将成体细胞转分化为神经细胞,为视神经再生治疗提供新策略。目的:构建携带鼠ASCL1基因的重组腺病毒表达载体,获得重组腺病毒pA d-rat-ASCL1-EGFP,以期为进一步研究ASCL1基因的功能奠定基础。方法:用XhoⅠ和EcoRⅠ将目的基因ASCL1及带有增强型绿色荧光蛋白表达盒的腺病毒穿梭载体p Yr-adshuttle-4进行双酶切;回收酶切质粒的目的片段进行连接,产物转化至DH5α感受态;提取质粒酶切鉴定正确后测序。然后通过LR体外同源重组将rat-ASCL1表达框构建至pA d/PL-DEST腺病毒表达载体,PacⅠ酶切线性化后用脂质体法转染HEK293细胞进行包装、扩增,采用PCR法对重组腺病毒进行鉴定,TCID50法测定病毒滴度,荧光显微镜观察病毒感染效率。结果与结论:通过酶切鉴定和DNA测序鉴定,证实重组腺病毒载体pA d-rat-ASCL1-EGFP构建正确,PCR鉴定扩增出862 bp的目的条带,TCID50法测定病毒滴度为2×1010pfu/mL。荧光显微镜观察HEK293细胞的病毒感染效率为80%以上。提示含ASCL1基因的重组腺病毒载体构建成功,获得的病毒具有高滴度,高效感染率,为下一步进行ASCL1基因功能研究和视神经再生治疗研究奠定了基础。
[Abstract]:Background: studies have shown that the neuroblast-specific transfer factor (ASCL1) is a key regulatory factor in the process of neural development. Therefore, by modifying adult cells with ASCL1 gene, it is possible to transform adult cells into neural cells. Objective: to construct a recombinant adenovirus expression vector carrying mouse ASCL1 gene. The recombinant adenovirus pAd-rat-ASCL1-EGFP1 was obtained in order to lay a foundation for further study on the function of ASCL1 gene. Methods: the target gene ASCL1 and the adenovirus shuttle vector p Yr-adshuttle-4 with enhanced green fluorescent protein expression cassette were digested by Xho 鈪，

本文编号：1692470