硫醇转移酶的基因敲除及功能在白内障发病中的究

发布时间：2018-04-09 08:23

  本文选题：硫醇转移酶　切入点：白内障　出处：《第四军医大学》2011年博士论文

【摘要】：第一部分：硫醇转移酶基因敲除小鼠模型的建立及其白内障形成机制的研究 目的： 硫醇转移酶(Thioltransferase, TTase)是维持晶状体中氧化还原状态的重要一员。本研究通过建立TTase基因敲除小鼠的模型，观察晶状体的形态和生化方面随年龄的改变，来探讨TTase在晶状体氧化还原系统中的重要作用及参与年龄相关性白内障形成的主要机制。 方法： 建立TTase基因敲除小鼠模型，裂隙灯观察比较1-20月龄TTase基因敲除型和野生型小鼠的白内障随年龄的发生情况。比较晶状体中谷胱甘肽（Glutathione,GSH）的含量。采用Dionex分析仪测定晶状体中蛋白质谷胱甘肽二硫化物(Protein-GSH mixed disulfides, PSSG)和蛋白质半胱氨酸二硫化物(Protein-S-S-cysteine, PSSC)的含量。Western blot使用抗-GSH抗体观察两种基因型小鼠的晶状体及视网膜中PSSG的表达随年龄的变化。免疫共沉淀法鉴定形成PSSG的蛋白质。观察纯化的重组人晶状体TTase(Recombinant humanlens TTase, RHLT)对PSSG的脱硫醇作用。 结果： 裂隙灯检查结果表明，野生组和TTase基因敲除组中白内障的发生均随着年龄增加而增加，且混浊部位主要表现为核性。基因敲除组小鼠晶状体最早从4月龄开始发生混浊，而野生组最早从8个月开始出现混浊。20个月后，两组晶状体均发生明显的混浊。GSH的含量随着年龄的增加而降低，20个月后均出现明显降低，而基因敲除组与野生组相比没有显著差异。 PSSG的含量随年龄增加而缓慢增加，而12个月后基因敲除组比同年龄野生组含量较高；PSSC含量两组趋势相同，2-12月含量较低，20个月明显增高。Westernblot表明，晶状体中PSSG的表达也随着小鼠年龄的增加而缓慢升高。不同年龄组两种基因型小鼠比较，9月开始基因敲除型小鼠中PSSG的表达高于野生型。16月时两组PSSG的表达未见显著差异。视网膜中PSSG的表达也表现同样趋势。免疫共沉淀反应证实了形成的PSSG的蛋白质主要是肌动蛋白（Actin）和三磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehydes3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）。这种聚积的二硫化物可以被GSH还原，且与纯化的RHLT反应后更有效。 结论： 结果表明TTase基因敲除可以加速小鼠年龄相关性白内障的发生。晶状体中PSSG的聚积随年龄的增加而增加，且与晶状体的混浊程度相关。证实了TTase的在保持晶状体透明的重要作用。 第二部分：紫外线B诱导小鼠白内障的模型及相关晶状体形态和生化改变的研究 目的： 本研究通过建立紫外线B(UVB)诱导C57BL/6小鼠白内障的模型，，观察不同年龄小鼠晶状体的形态和生化方面经紫外线照射后的改变，来探讨晶状体抗氧化系统在紫外辐射引起的氧化损伤中的重要作用。 方法： 1月和16月C57BL/6小鼠给予UVB(302nm,14.4KJ/m2)15分钟照射，48小时后裂隙灯下观察小鼠晶状体变化及收集晶状体上皮（含囊膜）。测定晶状体中谷胱甘肽（Glutathione, GSH）的含量及三磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehydes3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）和硫醇转移酶(Thioltransferase, TTase)的活性。Western blot观察两组小鼠的晶状体中蛋白质和GSH形成的二硫化物(Protein-GSH mixed disulfides, PSSG),TTase和硫氧还蛋白(Thioredoxin, Trx)表达的变化。 结果： 1月和16月组均出现明显晶状体混浊，混浊部位主要表现为前囊膜下点状混浊。晶状体上皮中GSH的含量照射后均下降。与同年龄对照组相比，1月照射组GSH下降了10％，16月照射组下降了25％。GAPDH活性也呈现同样趋势，16月照射组下降了29％，而1月照射组下降了26％。晶状体中TTase活性1月照射组与对照组相比活性增加了16％。Western blot显示，上皮中PSSG的表达随年龄增加而增加，且经紫外线照射后表达明显增加，16月组中较显著。同时晶状体中TTase和Trx抗氧化酶的表达出现增高。 结论： 结果表明晶状体随年龄增加对紫外线损伤的抵抗能力下降。同时TTase和Trx等抗氧化酶的表达上调也说明了他们可能在紫外线引起的氧化损伤中发挥重要作用。
[Abstract]:The first part: the establishment of a mouse model of thiol transferase gene knockout and the study of the mechanism of cataract formation
Objective:
Thioltransferase (Thioltransferase, TTase) is an important member in maintaining the redox state of the lens. In this study, through the establishment of TTase gene knockout mice model, observe the morphological and biochemical aspects of lens change with age, to explore the role of TTase in oxidative reduction an important role in the system and the main mechanism involved in the formation of age-related cataract.
Method锛

本文编号：1725632