骨桥蛋白及其单克隆抗体调控青光眼手术后瘢痕形成的研究

发布时间：2018-04-11 05:46

  本文选题：骨桥蛋白 + 人Tenon’s囊成纤维细胞　； 参考：《第二军医大学》2014年博士论文

【摘要】：研究目的 骨桥蛋白（Osteopontin，OPN）是功能复杂的磷酸化糖蛋白，可以诱导成纤维细胞增殖、新生血管形成，是调控瘢痕形成的重要因子。本研究探讨OPN对人Tenon’s囊成纤维细胞（human tenon’s fibroblasts，HTFs）的调控作用及在抗青光眼手术条件下对手术区域局部瘢痕形成的影响，对其发挥生物学作用的机制进行研究，以拓展对青光眼手术瘢痕形成机制的认识，并评价自主研制的OPN单克隆抗体1A12是否能抑制青光眼手术后瘢痕的形成，为预防青光眼术后瘢痕形成提供新的思路。 研究方法 1、OPN在HTFs中的作用及机制探讨（体外实验） 不同浓度（0，0.05μM，0.5μM和5μM）的OPN，，OPN联合1A12（5μMOPN+20μg/ml1A12）对HTFs进行处理，采用MTT法检测HTFs的增殖速度，并采用细胞划痕法检测HTFs的移行速度。不同浓度（0，0.05μM，0.5μM和5μM）的OPN，OPN联合MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路抑制剂PD98059、LY294002（5μM+10μM+30μM），OPN联合1A12（5μM OPN+20μg/ml1A12）对HTFs进行处理，采用实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测HTFs中的VEGF和TGF-β的mRNA水平变化，并采用Western blotting检测HTFs中的I型胶原蛋白以及信号传导通路上的p-ERK、p-AKT、p-IKKα和p-NFκB的蛋白表达，探讨OPN调控HTFs增殖移行的信号传导通路机制。 2、OPN在兔眼抗青光眼手术区域的作用及机制探讨（动物实验） 建立抗青光眼手术兔眼模型，随机分为四组，A组为NS组，术中，术后第1，2，7d结膜下注射0.1ml NS；B组为MMC组，术中在Tenon’s囊放置0.4mg/ml MMC棉球5分钟，术后第1，2，7d结膜下注射0.1ml NS；C组为OPN组，术中，术后第1，2，7d结膜下注射0.1ml（2.5μg）OPN；D组为1A12组，术中，术后第1，2，7d结膜下注射0.1ml（10μg）1A12。观察兔眼抗青光眼手术区域的滤过泡形态、滤过泡相对面积和高度，以及眼压的动态变化。对四组手术区域进行切片和病理学观察，包括HE染色，马森三色染色，网状纤维染色，α-平滑肌肌动蛋白染色（α-SMA）和Ki67染色。Real-time PCR方法检测四组不同时间点手术区域组织中OPN、VEGF、TGF-β和I型胶原蛋白的mRNA水平变化。Western blotting检测四组不同时间点手术区域组织中I型胶原蛋白、p-ERK和p-AKT的蛋白表达。 结果 1、OPN促进体外培养的HTFs增殖和移行，该效应可以被1A12抑制。OPN处理组的HTFs增殖能力增强，移行速度加快，而且随着OPN的浓度增加（0，0.05μM，0.5μM和5μM）而增加。给予1A12（5μM OPN+20μg/ml1A12）处理后HTFs增殖和移行速度变慢。 HTFs的VEGF和TGF-β的mRNA含量均为微量，不同浓度的OPN处理后VEGF和TGF-β的mRNA表达水平变化无统计学意义。OPN处理后HTFs中I型胶原蛋白的蛋白表达上调，并且呈浓度依赖性（0，0.05μM，0.5μM和5μM）。该作用既可以被MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路抑制剂PD98059、LY294002抑制，也可以被OPN抗体1A12抑制。随着OPN浓度的增加，p-ERK、p-AKT的蛋白表达也随之上调，该作用同样可以被PD98059或LY294002抑制，也可以被1A12抑制。p-IKKα和p-NFκB的蛋白表达不随OPN浓度变化而变化，也不被1A12所抑制。 2、OPN促进兔眼抗青光眼手术区域瘢痕化，该效应可以被1A12抑制。 四组抗青光眼手术兔眼模型，术后滤过泡相对面积和高度缩小所需的时间：OPN组最短，其次是NS组，MMC组和1A12组最长，MMC组与1A12组之间差异无统计学意义。滤过泡壁1A12组相对较厚，接近正常结膜组织，而MMC组滤过泡苍白、菲薄，呈囊状。四组不同时间点的眼压比较：术前、术后第1d、3d和5d差异无统计学意义，术后第7d时OPN组高于其他三组，术后14d和21d时NS组与OPN组差异无统计学意义，两组均高于MMC组和1A12组，术后28d时四组间比较差异无统计学意义。 病理学观察：抗青光眼手术区域组织的马森三色染色和网状纤维染色显示OPN组巩膜胶原纤维比其他三组更加致密。α-SMA染色阳性分值OPN高于MMC组和1A12组，与NS组比较差异无统计学意义。结膜及结膜下Ki67染色，巩膜瓣切口周围Ki67染色阳性分值OPN组高于其他三组，差异有统计学意义。 手术区域VEGF和TGF-β的mRNA含量均为微量，同一时间点四组VEGF和TGF-β的mRNA含量比较差异无统计学意义。与NS组相比，手术区域中I型胶原蛋白的mRNA和蛋白的表达，OPN组上调，MMC组和1A12组下调，该效应在术后早期（第3d）尤其明显。与NS组相比，手术区域的p-ERK、p-AKT的蛋白表达，OPN组上调，MMC组和1A12组下调，与细胞实验的结果相符。 结论 OPN促进HTFs的增殖和移行，呈浓度依赖性，该效应可被OPN单克隆抗体1A12所抑制。OPN与MAPK/ERK和PI3K/AKT信号传导通路关系密切，上调OPN可以激活MAPK/ERK和PI3K/AKT信号传导通路，从而诱导这两条信号传导通路下游的分子细胞生物学效应。OPN通过激活MAPK/ERK和PI3K/AKT信号传导通路诱导HTFs中I型胶原蛋白的表达，其抗体1A12可以抑制这种效应。OPN上调抗青光眼术后滤过泡区域I型胶原蛋白的表达，在此过程中激活MAPK/ERK和PI3K/AKT相关信号传导通路，1A12可以抑制这种效应。OPN加重青光眼术后瘢痕化，1A12抑制青光眼术后瘢痕化。本研究提出应用自主研制的OPN单克隆抗体1A12抑制青光眼术后瘢痕形成的新思路，为将1A12应用于抗青光眼手术以减轻术后滤过道瘢痕化的临床研究奠定了实验基础。
[Abstract]:Purpose of study

Osteogenic ( osteolytic ) is a complex functional phosphorylated glycoprotein , which can induce the proliferation of fibroblasts and the formation of neovascularization , which is an important factor for the regulation of scar formation . This study explored the mechanism of promoting the formation of scar formation in glaucoma surgery under the condition of anti - glaucoma surgery , and evaluated whether the self - developed anti - scar formation mechanism of the monoclonal antibody 1A12 can inhibit the formation of scar after glaucoma surgery , and provide a new idea for preventing scar formation after glaucoma .

Research Methods

Study on the Role and Mechanism of 1 , 2 in HTFs ( In Vitro Experiment )

The expression of VEGF and TGF - 尾 mRNA in HTFs was detected by MTT assay , and the expression of p - ERK , p - ERK , p - IKK伪 and p - NF - 魏B in HTFs was detected by real - time fluorescence quantitative PCR ( Real - time PCR ) .

Study on the role and mechanism of 2 銆

本文编号：1734705