DHDDS基因对视网膜感光细胞的作用和机制研究

发布时间：2018-04-11 19:10

  本文选题：视网膜色素变性 + 糖基化　； 参考：《天津医科大学》2013年博士论文

【摘要】：目的:视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP)是遗传性视觉损害和致盲的常见原因之一,其主要病理特征为视网膜感光细胞进行性的变性和不可逆转的死亡,且临床异质性较高,有多种遗传方式。最近研究发现一种新的导致无症状进展性RP 的基因 DHDDS(dehydrodolichol diphosphate synthase)K42E 突变。DHDDS 是脱氢长萜基二磷酸合成酶是一种高度保守的长醇合成酶,催化顺-戊二烯链的延长形成长醇骨架(Dedol-PP),在糖基化过程中起到关键作用。为了进一步研究脱氢长萜基二磷酸合成酶和糖基化过程在视网膜组织的作用,本研究通过建立DHDDS完全性基因敲除和条件性基因敲除小鼠动物模型和使用糖基化抑制剂衣霉素(Tunicamycin,TM)阻断视网膜糖基化,观察分析其表型,明确糖基化障碍作为一种新的RP发病机制。方法:1.将含有插入"SA-βgeo-pA"片段导致无义突变DHDDStmla等位基因的小鼠胚胎干细胞经显微注射胚囊中,发育出生5只嵌合基因小鼠(chimericmice)。将嵌合基因小鼠与野生型小鼠交配,产生携带有DHDDStmla的第一代子代(F1)转基因小鼠。2.将DHDDSfl/fl与表达重组酶Cre(recombinase)的两种工具鼠合笼,产生在LMOP 启动子(long-mouse opsin promotor)和 Chx10 启动子驱动下,Cre 重组酶特异性识别loxP位点重组后敲除DHDDS基因中第4外显子,产生分别在发育期神经视网膜和成熟的视网膜感光细胞内条件性DHDDS基因敲除小鼠。3.记录暗适应和明适应条件下的视网膜电图(Electroniretinograms,ERG),检测视网膜功能学变化。按不同月龄为观察点取视网膜组织行塑料切片染色光镜下观察。4.将在500bp鼠视紫红质(murine rhodopsin)启动子驱动下表达Cre重组酶的AAV2病毒注射入DHDDSf1/fl小鼠视网膜下间隙内,Cre特异识别DHDDS基因的第四外显子两侧内含子区域两个同向的loxP位点,致使基因DHDDS第4外显子被选择性敲除,得到DHDDS条件性敲除小鼠。注射后1个月,用免疫荧光的方法检测病毒转染细胞表达Cre及GFP(green fluorescent protein)的定位情况。注射后1个月、2个月按不同月龄为观察点小鼠行视网膜组织塑料切片染色光镜下观察。5.衣霉素(tunicamycin,TM)溶于DMSO后以浓度为25ng/μl及50ng/μl注射入成年Balb/c小鼠玻璃体腔2μl。注射药物1周、2周、4周为观察点小鼠行相干光断层扫描(OCT)、ERG、视网膜组织塑料切片染色光镜下观察。用Western Blotting方法检测视网膜感光细胞内蛋白视紫红质的表达变化,进一步明确糖基化在视网膜感光细胞的作用和机制。结果:1.转基因小鼠DHDDS+/-视网膜组织发育完整,形态结构正常。视网膜电图ERG结果显示视网膜功能正常。观察DHDDS+/-、鼠后代胚胎发育第7日,1/4胚胎形态异常,未出现胚盘结构,内外胚层结构模糊紊乱,且DHDDS+/-小鼠回交后代未发现子代出现DHDDS-/-小鼠基因型,推测DHDDS-/-为胚胎致死。2.DHDDSfl/LMOP-Cre小鼠和DHDDSfl/Chx10-Cre小鼠均表现出视网膜感光细胞的结构异常,出现变性死亡,ERG示视网膜感光细胞功能异常。3.AAV-Rho-GFP注射眼视网膜感光细胞结构功能未见异常。AAV-Rho-Cre注射眼视网膜感光细胞变性死亡减少。4.衣霉素玻璃体腔注射后一个月内,50ng组和100ng组均出现感光细胞变性凋亡减少,ERG示感光细胞功能异常。蛋白免疫分析证实,感光细胞中视紫红质被去糖基化。结论:DHDDS基因介导的蛋白质糖基化过程在生命初期生物体胚胎发育过程中发挥重要作用。DHDDS基因缺失或异常导致蛋白质糖基化这一蛋白质翻译后修饰过程失败,可引起视网膜变性疾病。TM阻滞视网膜蛋白质糖基化后亦出现视网膜变性,感光细胞死亡,视网膜功能丧失。感光细胞对于糖基化长醇通路障碍十分敏感,糖基化长醇通路机制是视网膜变性疾病发病的可能机制之一。
[Abstract]:Objective : To study the role of DHDDS ( DHDDS ) as a new RP gene . Results : 1 . DHDDS + / - retinal tissue was developed intact and its morphology was normal . The results showed that DHDDS + / - retinal tissue was completely developed and its morphology was normal .

【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R774.1

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本文编号：1737301