冻融抗原致敏的DC-CIK细胞对视网膜母细胞瘤RB-Y79细胞杀伤作用的实验研究

发布时间：2018-06-14 20:49

  本文选题：树突状细胞 + 细胞因子诱导的杀伤细胞　； 参考：《新乡医学院》2013年硕士论文

【摘要】：目的： 本实验通过分离健康人外周血单个核细胞,应用不同的细胞因子体外诱导分化出树突状细胞(Dendritic Cells, DC)和细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-induced killer cells, CIK)细胞,将冻融抗原(Antigen, Ag)致敏DC并与CIK细胞共培养。 (1)观察视网膜母细胞瘤(Retinoblasotma, RB)细胞株RB-Y79细胞冻融抗原致敏的DC与CIK细胞共培养后,DC与CIK细胞的形态学改变、细胞表型以及细胞增殖情况的变化； (2)探讨冻融抗原致敏的DC-CIK细胞(DC-Ag-CIK细胞)对RB-Y79细胞的杀伤作用以及联合应用卡铂后对RB-Y79细胞的协同杀伤作用。 (3)探讨DC-Ag-CIK细胞联合卡铂对RB-Y79细胞可能的杀伤机制。 方法： (1)观察冻融抗原致敏的DC与CIK细胞的体外增殖与生物学活性。取健康人外周血单个核细胞,加入不同细胞因子培养DC及CIK细胞,第3天用RB-Y79细胞冻融抗原致敏DC并于第7天将DC与CIK共培养,分为CIK组, DC-CIK组和DC-Ag-CIK组。第7天倒置显微镜下观察DC及CIK细胞形态,以及3组细胞在共培养后的增殖情况。流式细胞仪检测DC第3、7天及CIK细胞第7、15天的细胞表型变化。CBA细胞因子试剂盒检测共培养至第15天时3组细胞上清液中IL-6及IL-10的含量。 (2)检测杀瘤活性。PI法检测卡铂对RB-Y79及hTERT-RPE1细胞的杀伤活性；CFSE/PI法检测效应细胞(CIK、DC-CIK及DC-Ag-CIK细胞)在不同效靶比下对RB-Y79细胞、hTERT-RPE1细胞(正常视网膜色素上皮细胞)、RB耐药细胞(RB-resistant cells, RB-R)的杀伤作用,以及效应细胞联合卡铂对RB-Y79细胞的杀伤作用和CIK细胞在不同培养液条件下对RB-Y79细胞的杀伤活性; CFSE/PI法检测卡铂与DC-Ag-CIK细胞在不同应用顺序下对RB-Y79细胞的杀伤作用。 (3)在RB-Y79细胞上转染GFP绿色荧光蛋白并筛选出RB-GFP细胞,免疫荧光显微镜拍摄卡铂和／或DC-Ag-CIK细胞对RB-GFP细胞的动态杀瘤过程；免疫荧光染色法及流式细胞术检测卡铂和／或DC-Ag-CIK细胞作用RB细胞后,RB细胞膜外Annexin V蛋白的表达情况。 结果： (1)经过培养的DC呈现出典型的“树突状”结构,CIK细胞则聚集成团。培养至第15天时,DC-Ag-CIK和DC-CIK组的细胞数绝对值明显高于CIK组(P0.01),DC-CIK组与DC-Ag-CIK组的IL-6含量明显高于CIK组,而DC-Ag-CIK组IL-10含量明显低于CIK组与DC-CIK组(P0.01)。经过7天的培养,DC细胞表型CD80、CD83、CD86的表达率均明显高于第3天时的DC细胞(P0.01)。第15天的各组CIK细胞的细胞表型均明显高于第7天未与DC共培养时的CIK细胞(P0.01),而在第15天的CIK组、DC-CIK组及Ag-DC-CIK组中,Ag-DC-CIK组的CD3+CD56+及CD3+CD8+表达率均明显高于CIK组及DC-CIK组(P0.01)。 (2)效应细胞随着效靶比的增高对RB-Y79细胞的杀伤活性也随之增高,在相同效靶比下,Ag-DC-CIK细胞对RB-Y79细胞的杀伤活性明显高于CIK组与DC-CIK组(P0.05)；效应细胞对正常视网膜色素上皮细胞hTERT-RPE1细胞几乎没有杀伤作用,且各组效应细胞之间没有明显差异(P0.05)；CIK细胞在三种不同培养液条件下对RB-Y79细胞的杀伤活性无明显差异(P0.05)；在效应细胞与卡铂联合作用后,在相同效靶比的条件下对RB-Y79细胞的杀伤活性明显高于单独应用效应细胞和单独应用卡铂(P0.01),同时对RB耐药细胞的杀伤活性也明显高于单独应用效应细胞(P0.01)；在两次卡铂中加入应用DC-Ag-CIK细胞后,其杀瘤率高(71.16±4.65%),与其他各组相比具有非常显著的统计学差异(P0.01)。 (3)当RB-GFP细胞死亡时,RB细胞的绿色荧光消失,同时变被PI染成红色。RB细胞预先与卡铂共培养12小时后再加入DC-Ag-CIK细胞,其出现RB凋亡细胞比单独应用卡铂及单独应用DC-Ag-CIK细胞需较短的时间；DC-Ag-CIK组Annexin V阳性细胞表达率明显高于CIK组及DC-CIK组(P0.01),与CIK细胞组相比,DC-Ag-CIK细胞能引发更多的RB凋亡细胞(P0.01),卡铂联合DC-Ag-CIK细胞后,其引发RB凋亡细胞数明显多于DC-Ag-CIK组及单独卡铂组(P0.01)。 结论： (1)RB冻融抗原致敏的DC与CIK细胞共培养后,可促进DC及CIK细胞的成熟与分化,使CIK细胞具有更强的增殖活性,并与IL-6的分泌上调以及IL-10的分泌下调有关。 (2)RB冻融抗原致敏的DC可增强CIK细胞对RB-Y79细胞的特异性杀伤作用,可能由于DC-Ag与CIK细胞共培养后可使CIK细胞大量增殖并诱导出大量CD3+CD56+的T细胞,从而提高了杀瘤活性。而DC-Ag-CIK细胞对正常视网膜色素上皮细胞(hTERT-RPE1细胞)无明显杀伤作用。 (3)效应细胞联合卡铂后对RB-Y79细胞及RB-R细胞均可产生明显的协同杀伤作用,DC-Ag-CIK细胞联合低剂量的卡铂对RB-Y79细胞仍可产生明显的杀瘤效果。 (4)卡铂联合DC-Ag-CIK细胞后能缩短杀瘤时间,其杀瘤机制可能是通过增加诱导RB细胞出现早期凋亡。
[Abstract]:Objective:
In this experiment, the human peripheral blood mononuclear cells were isolated from healthy human peripheral blood, and different cytokines were used to induce Dendritic Cells (DC) and cytokine induced killer cells (Cytokine-induced killer cells, CIK) cells, and to sensitized DC with freeze-thaw antigen (Antigen, Ag) and co culture with CIK cells.
(1) to observe the morphological changes of DC and CIK cells, the changes of cell phenotype and cell proliferation after the co culture of DC and CIK cells sensitized by the freeze-thaw antigen of Retinoblasotma (RB) cell line RB-Y79 cells.
(2) to investigate the killing effect of DC-CIK cells (DC-Ag-CIK cells) sensitized by freeze-thaw antigen on RB-Y79 cells and the synergistic killing effect of combined application of carboplatin on RB-Y79 cells.
(3) to explore the possible killing mechanism of DC-Ag-CIK cells combined with carboplatin on RB-Y79 cells.
Method锛，

本文编号：2018915