基质金属蛋白酶及粘着斑激酶在单疱病毒性角膜炎中的表达及调节机制的研究

发布时间：2018-06-17 03:38

  本文选题：单疱病毒性角膜炎 + 基质金属蛋白酶　； 参考：《武汉大学》2014年博士论文

【摘要】：第一部分实验性小鼠单纯疱疹角膜炎中基质金属蛋白酶及粘着斑激酶的表达 目的：探讨I型单纯疱疹病毒(]herpes simplex virus-1,HSV-1)感染Ba1B/c小鼠眼角膜所致的基质金属蛋白酶2(matrix metallo proteinases-2, MMP-2)及粘着斑激酶(Focal adhesion kinase, FAK)表达的变化。方法：雌性BALB/c小鼠40只随机分为4组,每组10只,每只均取右眼为实验眼。搔刮角膜上皮后点滴1型单纯疱疹病毒(HSV-1)诱发单纯疱疹性角膜炎(HSK)。裂隙灯下每日观察小鼠角膜变化并分别于感染后第0,2,7,14天处死小鼠,每组取5只小鼠的感染眼球行石蜡包埋,并应用抗MMP-2,抗FAK的多克隆抗体免疫染色角膜切片,应用免疫组织化学法检测MMP-2及FAK表达。收集每组另5只小鼠的感染角膜,抽提角膜组织中总RNA,将RNA逆转录为cDNA后进行PCR扩增,扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳,采用计算机凝胶成像系统提取图像并分析电泳条带灰度值。采用方差分析SNK-q检验对实验数据进行半定量分析。 结果：感染后小鼠均可见典型的单纯疱疹性角膜炎表现,裂隙灯下观察感染后第2天见树枝状上皮缺损,继而发生浅层基质炎症,炎性细胞浸润,第7天后角膜基质水肿,基质浸润,溃疡形成及新生血管形成,至第14天逐步加重。免疫组化显示感染后第2天,MMP-2及FAK的表达比未感染眼增加且表达主要位于浅表基质层及上皮下的炎性细胞中。感染后第7天,MMP-2及FAK的表达较第2天减弱。而感染后第14天可见角膜基质中及浸润的炎性细胞中尤其是溃疡处可见MMP-2及FAK的表达再次显著增加。总体来看HSK模型的角膜上皮细胞排列紊乱,基质水肿,中性粒细胞增多,MMP-2及FAK阳性细胞数增多,同阴性对照组相比差异具有统计学意义(P0.05)。RT-PCR结果显示MMP-2,FAKmRNA的表达大体上随感染天数增加呈增高的趋势。其中MMP-2mRNA的表达在感染后第0天与第2天差异没有显著性(P0.05),感染后第7,14天mRNA的表达逐渐增高差异有显著性意义(P0.01)。FAKmRNA的表达在感染后第0天,第2天,第7天逐渐增高,第14天表达达到最高值,但其中第7天较第2天的增高差异没有显著性(P0.05),其余各组差异均有显著性意义(P0.01)。 结论：HSV-1感染角膜后,中性粒细胞与角膜细胞释放大量的蛋白水解酶MMP-2,并且在实验性小鼠HSK动物模型中检测到了FAK在角膜上皮细胞中大量表达,其表达趋势随感染时间的延长呈阶梯向上的波形,推测二者在角膜上皮炎、角膜溃疡穿孔、新生血管形成等过程中发挥重要作用。 第二部分HSV-1感染对人角膜上皮细胞中基质金属蛋白酶及粘着斑激酶的表达及调节机制的研究 目的：探讨I型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus-1,HSV-1)感染对体外培养人角膜上皮细胞MMP-2和FAK表达的影响。 方法：采用组织块培养法(组织块来自穿透性角膜移植术后剩余供体角膜)行人角膜上皮细胞原代培养及细胞传代。对培养细胞行生物学性状的鉴定,包括倒置显微镜的观察和免疫组织化学染色鉴定。取2-4代细胞进行实验。以HSV-1(F株)感染体外培养人角膜上皮细胞(human corneal epithelial cell, HCE), Lipofectamine介导法基因转染,应用聚合酶链反应法、免疫印迹法、免疫组织化学法、免疫荧光法分别于2h、20h、40h检测HCE基质金属蛋白酶2(matrix metallo proteinases-2,MMP-2)和粘着斑激酶(Focal adhesion kinase, FAK)表达情况。结果：感染后2h、20h、40h, MMP-2和FAKmRNA表达分别同非感染细胞相比显著增强(P0.01,P0.05)；感染后2h MMP-2、YAK、P-FAK蛋白表达同非感染细胞相比无显著差别(p0.05)；感染后20h、40h、MMP-2、FAK、P-FAK蛋白表达同非感染细胞相比差别显著(p0.05) 结论：在HSV-1感染的早期,磷酸化的FAK在病毒入侵细胞和MMP-2的激活过程中起着重要作用。FAK参与了MMPs的表达和激活,同时FAK蛋白自身激活后可促进MMPs的表达和活性增加,FAK激活MMP-2的具体通路有待进一步研究。
[Abstract]:Expression of matrix metalloproteinases and focal adhesion kinase in experimental mice with herpes simplex keratitis

Objective : To investigate the changes of matrix metallo - 2 ( MMP - 2 ) and focal adhesion kinase ( focal adhesion kinase ) expression induced by herpes simplex virus - 1 ( HSV - 1 ) infection in mice . Methods : 40 female BALB / c mice were randomly divided into 4 groups .

Results : After infection , the expression of MMP - 2 , MMP - 2 was significantly higher than that in the negative control group ( P0.05 ) .

Conclusion : After infection with HSV - 1 , neutrophils and corneal cells release a large amount of proteolytic enzyme MMP - 2 , and the expression of focal adhesion kinase in corneal epithelial cells was detected in experimental mice .

Study on the expression of matrix metalloproteinases and focal adhesion kinase in human corneal epithelial cells by HSV - 1 infection

Objective : To investigate the effect of herpes simplex virus - 1 ( HSV - 1 ) infection on the expression of MMP - 2 in human corneal epithelial cells in vitro .

Methods : The expression of matrix metallo - 2 , matrix metallo - 2 , MMP - 2 and focal adhesion kinase in cultured human corneal epithelial cells ( HCE ) were detected by polymerase chain reaction ( PCR ) , Western blotting , immunohistochemistry and immunofluorescence . The results showed that the expression of MMP - 2 and FAKmRNA in cultured human corneal epithelial cells ( HCE ) , MMP - 2 and MMP - 2 were significantly increased at 2h , 20 h , 40 h after infection ( P0.01 , P0.05 ) .
The expression of MMP - 2 , YAK and P - C protein in 2 hours post - infection was not significantly different from that of non - infected cells ( p < 0.05 ) .
Compared with non - infected cells ( p < 0.05 ) , the expression of MMP - 2 , focal adhesion kinase and the protein in the infected cells were significantly higher than those of non - infected cells ( P < 0.05 ) .

Conclusion : In the early stage of HSV - 1 infection , the phosphorylation of focal adhesion kinase plays an important role in the activation of the virus invading cells and MMP - 2 .
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R772.21

【共引文献】

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本文编号：2029505