HSF4b表达载体的构建及其稳定株的筛选

发布时间：2018-06-18 05:16

  本文选题：热休克转录因子4 + 慢病毒载体　； 参考：《河南大学》2010年硕士论文

【摘要】： 背景 先天性白内障是导致儿童失明的主要原因,大约0.3- 1.5/1000的儿童患有先天性白内障,它的主要病理改变为晶状体发育迟缓,晶状体内非透明瘢块组织形成,染色体异常为主要致病原因。已经发现多种基因的突变体与临床及动物实验性先天性白内障发生有关。例如编码晶状体细胞结构蛋白相关基因的突变(MIPs, CP49 and alpha-, beta-和gamma- crystallins)和调控晶状体发育相关的转录因子的基因突变(Pax6, FoxE3, Six3, Prox1, Sox2/3, Maf, Pitx3, AP-2a和Hsf4)。2002年,BU等对国人一个先天性白内障家系进行连锁分析时,将致病的基因定位于16号染色体,确定了Hsf4是先天性白内障的候选基因,它的发生机制为Hsf4基因的第348位核苷酸T突变为C,使Hsf4的DNA结合域内的第115位高度保守的亮氨酸转变为脯氨酸,而最终导致白内障的发生。应用转基因技术敲除小鼠的Hsf4基因可以使小鼠在出生后3-5天(P3-5)出现白内障,该结果有力的支持Hsf4是调控晶状体早期发育的重要转录因子的论点。但是,调控Hsf4转录活性的信号通路及Hsf4调控晶状体早期发育的分子机理还不清楚。因此,研究Hsf4在晶状体发育过程中的生物学调控作用对揭示突变型Hsf4的致病机理及早期诊断和治疗与Hsf4突变相关的先天性白内障有着重要的意义。为此我们构建了Hsf4的真核表达载体pcDNA3.0/Hsf4b,然而pcDNA3.0/Hsf4b转染MLEC(Hsf4b-/-)晶状体上皮细胞的转染效率较低,对探求Hsf4b调控晶状体发育的分子机制的研究较难进行。体外建立一个转染效率高且稳定表达Hsf4b的细胞株对我们进一步研究Hsf4b的生物学功能有重要的意义。 目的 构建Hsf4b的真核表达载体,便于研究Hsf4b在体外的功能。构建Hsf4b的重组慢病毒载体是为了能获得一株持续且稳定表达Hsf4b的细胞株。为以后继续研究Hsf4调控晶状体发育的分子机制奠定基础。 方法 用人心脏cDNA文库为模板,应用囊括Hsf4b全长的引物进行PCR并在Hsf4bcDNA的N-端加入Flag标签。将PCR产物经Kpn I和EcoR I酶切后,与该二酶线性化pcDNA3.0质粒一起连接获得重组质粒pcDNA-Flag-Hsf4b;做重组质粒上的定点突变;为了获得能持续且稳定表达Hsf4b的细胞株,将重组质粒pcDNA-Flag-Hsf4b和慢病毒表达载体Plentiviral用XholI和NdeI酶切后再连接获得Plentiviral-Flag-Hsf4b质粒,与病毒衣壳蛋白PLP1、PLP2、VSV-G一起转染入HEK293T细胞,用其分泌的含病毒的上清去感染MLEC细胞,并通过Blascitidin药物对其进行稳定筛选,用Western检测慢病毒表达载体Plenti/Hsf4b的表达情况,并检测相应下游蛋白Hsp25的表达。 结果 构建了Hsf4b的真核表达载体pcDNA-Flag-Hsf4b,将其转入HEK293T细胞显示能表达相应的蛋白,但是转染MLEC细胞时转染效率非常低,Western检测不到,我们研究发现其主要原因是重组质粒被转染入细胞后其表达的相应蛋白又结合于重组质粒的CMV上抑制Hsf4b相关蛋白的进一步表达。将构建好的Hsf4b真核表达载体作CMV上的定点突变,使这种抑制作用解除,最后获得了pcDNA-Flag-Hsf4b载体的突变体。测序结果及Western结果也证明了突变成功,插入片断在MLEC细胞中得到了表达。 为了使Hsf4b在MLEC细胞中稳定且持续表达,构建了Hsf4b的慢病毒表达载体并成功筛选出了一株能稳定表达Hsf4b的细胞株和一株Plentiviral(空载体)细胞株。Western(蛋白质免疫印迹)检测其下游小分子热休克蛋白Hsp25的表达,结果显示Hsf4b促进Hsp25的表达。 结论 利用基因工程技术,将Hsf4b的cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.0,构建了Hsf4b真核表达质粒pcDNA-Flag-Hsf4b,并在人胚胎肾细胞系293T中成功表达出蛋白。对质粒pcDNA-Flag-Hsf4b上CMV启动子成功定点突变,获重组质粒CMVm-Flag- Hsf4b。构建了Hsf4b慢病毒表达载体Plenti-Flag-Hsf4b,并成功转染至MLEC细胞中。获得一株稳定表达Hsf4b蛋白的细胞株MLEC/Plenti-Hsf4b。MLEC/Plenti-Hsf4b细胞株中小分子热休克蛋白Hsp25的表达升高。
[Abstract]:Background


In 2002 , it has been found that Hsf4 is a candidate gene for congenital cataract . It has been found that Hsf4 is a candidate gene for congenital cataract . It has been found that Hsf4 is a candidate gene for congenital cataract .


Purpose


The eukaryotic expression vector of HSV4b was constructed to study the function of Hs4b in vitro . The recombinant lentivirus vector was constructed in order to obtain a cell line which was continuously and stably expressing Hs4b . The molecular mechanism of Hsf4 was used to regulate the development of Hsf4 .


method


The recombinant plasmid pcDNA - Flag - HSV4b was digested by KpnI and EcoR I . The recombinant plasmid pcDNA - Flag - HSV4b and lentivirus expression vector were digested with XholI and NdeI .


Results


The eukaryotic expression vector pcDNA - Flag - Hs4b was constructed , and the recombinant plasmid pcDNA - Flag - Hs4b was transfected into the cells . However , the transfection efficiency was very low when transfected into MLEC . The results showed that the recombinant plasmid was transfected into the cells . The results showed that the recombinant plasmid was successfully transfected into the vector . The results of the sequencing and the Western blot showed that the mutation was successful and the inserted fragment was expressed in MLEC .


In order to stably and persistently express HSV4b in MLEC cells , a cell strain expressing Hs4b was constructed and a cell line stably expressing Hs4b was constructed . Western blot was used to detect the expression of Hsp25 in the downstream small molecular heat shock protein .


Conclusion


The recombinant plasmid pcDNA - Flag - HSV4b was constructed and the recombinant plasmid CMVm - Flag - HSV4b was successfully transfected into MLEC .
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R776.1

【参考文献】

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1 林燕瑜;李青;杨佩菲;;热休克转录因子4与先天性白内障[J];福建医药杂志;2007年04期

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本文编号：2034275