甲酰肽受体在电场引导人视网膜色素上皮细胞层损伤修复中的作用

发布时间：2018-11-28 20:09

【摘要】： 【研究背景】视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞层位于视网膜光感受器细胞与Bruch膜及脉络膜之间,支持着视网膜光感受器细胞,是维持视网膜结构和功能的重要组成部分。人RPE (human RPE,hRPE)细胞损伤性疾病,如年龄相关性黄斑病变(age-related macular degeneration,AMD)、增殖性玻璃体视网膜病变(proliferation vitreoretinopathy,PVR)以及视网膜色素变性等,是造成视力丧失的重要原因。RPE层一旦损伤,由病变区周围健康的RPE细胞向损伤区移行增生,以修复损伤区,这一过程对结构和功能的恢复十分重要。在细胞修复的过程中,有多种复杂的因素参与,其中伴有电场的作用。外加电场可以明显促进皮肤和角膜上皮损伤的修复。我们研究组前期的研究结果表明,在较短的时间内,电场能够引导hRPE细胞向负极移动,而且低于10 V/cm的电场强度对hRPE细胞的正常活性及分裂功能无明显不良影响。但是,单有外加电场的作用,似乎不足以促进hRPE细胞较快地移行修复缺损区。因此,我们试图寻找能够加快细胞在电场中移行的因子。有许多分子与细胞的移行有关。而人类甲酰肽受体(Formyl Peptide Receptor,FPR,1976年发现)是一种化学趋化受体,是介导细胞在一系列细胞因子的作用下移行的G蛋白偶联受体,与激动剂结合可以使PI3K,NF-κB和MAPK等激活,调节细胞的活化和移行。根据我们前期电场实验的结果,以及对FPR的文献回顾,推测可以将两者结合共同引入到促进RPE细胞移行修复的过程中,为RPE损伤性疾病的治疗提供一个新的治疗途径。【目的】 1.确定FPR在hRPE细胞的表达及定位;观察激活FPR,电场引导hRPE细胞层的移行修复,以及在此过程中细胞间连接mRNA的表达和其超微结构的变化,细胞骨架的变化。 2.研究此移行修复过程中PI3K/Akt信号通路的变化,Rho GTP ases家族蛋白的表达。 3.研究此移行修复过程中细胞因子,如表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、白介素(interleukin 8,IL-8)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1)和转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1 )的表达和分泌。【方法】 1.将hRPE细胞培养于含有fMLF(FPR经典激动剂)的培养液中,应用RT-PCR方法确定hRPE细胞表达FPR,免疫荧光染色方法着染FPR,从而进一步确定FPR在细胞上的表达与定位。根据本研究的前期实验结果,直接将细胞置于6 V/cm电场下,应用免疫荧光三标染色法着染FPR、F-actin以及胞核,通过激光共聚焦显微镜观察电场作用的hRPE细胞骨架F-actin和FPR的变化及定位关系。免疫荧光三标染色法着染细胞骨架F-actin、Vimentin及胞核,观察激活FPR促进电场引导hRPE细胞层的损伤修复以及电场引导下细胞骨架F-actin和Vimentin的变化。显微镜照相系统连续记录每1 h细胞移行的距离和细胞损伤范围的变化。并通过RT-PCR检测细胞间连接mRNA的表达,透射电子显微镜来观察细胞间连接的超微结构改变。 2.初步研究激活FPR受体通过PI3K / Akt信号转导通路激活Rho GTP ases家族中Cdc42、Rac1和RhoA,促进电场引导下hRPE细胞层移行修复。应用RT-PCR检测Cdc42、Rac和RhoA mRNA的变化,应用Western blotting检测PI3K / Akt,以及RhoA GTPases家族中Cdc42、Rac1和RhoA蛋白表达的变化。 3.观察激活FPR在电场作用下,采用RT-PCR和ELISA方法检测EGF、IL-8、MCP-1和TGF-β1的表达和分泌,以及加入FPR拮抗剂,PI3K/Akt阻断剂和Rho GTP ases阻断剂后因子的表达和分泌变化。【结果】 1.首次确定了hRPE细胞表面存在FPR。应用FPR经典激动剂fMLF激活hRPE细胞的FPR,通过RT-PCR检测到hRPE细胞的FPR mRNA表达。同时揭示FPR与F-actin之间存在共定位关系。在电场作用下,hRPE细胞向阴极方向伸出伪足,朝向阴极的方向移行,FPR与F-actin在细胞的伪足上共定位,而在拮抗剂Boc和激动剂fMLF作用下,hRPE细胞的FPR表达减少。在电场和FPR的作用下,可以明显促进hRPE细胞层的移行和损伤修复。将hRPE细胞培养于无血清培养液组,20%血清培养液组及fMLF培养液组,电场作用3 h后,hRPE细胞层的移行距离分别为24.262±6.82μm,40.243±5.069μm(1.7倍),和56.926±7.821μm(2.4倍)。在无血清培养液组,20%血清培养液组和fMLF培养液组中可检测出CX-43和ZO-1 mRNA的表达,而E-cadherin mRNA的表达却分别在2 h,30 min和1 h时检测到。透射电镜可以观察到细胞间连接的的超微结构:包括紧密连接,缝隙连接,桥粒样结构和粘着斑。电场下细胞骨架的空间结构发生改变,细胞伪足朝向阴极方向,并表达F-actin,其荧光亮度在1 h时,达到峰值106.49±8.21,随后逐渐下降。 2.在电场作用下,Western blotting结果显示pAkt在hRPE细胞中的表达,均在30 min时达到最高,无血清培养液组为0.6±0.012,20%血清培养液组1.36±0.093,含fMLF培养液组为2.44±0.089。加入FPR拮抗剂Boc后,发现pAkt蛋白的表达量明显降低。通过RT-PCR检测到Rho GTP ases家族中Cdc42、Rac1和RhoA mRNA的表达在激活FPR受体后在30 min时明显增加,Western blotting的结果提示其蛋白表达量在电场作用1 h时明显增加,在含fMLF培养液组增加明显,分别为3.5±0.2,5.5±0.21,4.78±0.22,加入PI3K/Akt通路阻断剂LY294002后,Rho GTP ases家族中Cdc42、Rac1和RhoA的表达明显降低。 3.在电场作用下,RT-PCR结果显示EGF、IL-8、MCP-1和TGF-β1 mRNA表达在1 h时达到高峰,而ELISA结果提示培养液上清中四种因子的分泌量在2 h时,达到高峰,含fMLF培养液组四种因子的表达量和分泌量较其他组升高明显。加入FPR拮抗剂Boc,PI3K/Akt信号转导通路阻断剂LY294002以及Rho GTP ases阻断剂Y27632,发现EGF、IL-8、MCP-1和TGF-β1的表达量和分泌量下降。【结论】 1.首次确定hRPE细胞表达FPR,并与细胞骨架F-actin共定位表达。激活FPR,在电场作用下,hRPE细胞发生形态和极性的改变,朝向阴极伸出伪足,向阴极移行,在细胞伪足上可见FPR与F-actin共定位,说明FPR的激活与hRPE细胞的移行修复有关。激活hRPE细胞FPR,显著促进了RPE细胞层在电场作用下的移行,并能引起细胞骨架蛋白F-actin的改变。细胞间连接mRNA的表达及其超微结构的观察,说明hRPE细胞层的损伤修复是成层移行的。 2.激活hRPE细胞FPR,在电场作用下,通过PI3K/Akt信号转导通路的激活,活化Cdc42、Rac1和RhoA蛋白,说明FPR的作用至少是通过PI3K/Akt的信号转导通路实现的。 3.激活hRPE细胞FPR,在电场作用下,诱导EGF、IL-8、MCP-1和TGF-β1的表达和分泌,而且与FPR激活、PI3K/Akt激活、Rho GTP ases活化相关。以上研究国内外未见相关报道。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R774.1

【参考文献】