【摘要】： 视网膜新生血管性眼底病是一类常见的致盲性疾病,如早产儿视网膜病变、糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞等均可因新生血管增生、牵拉而导致视网膜脱离。视网膜新生血管的发生原因至今仍不是十分清楚,是眼科关注的重点问题之一。视网膜缺血、缺氧是形成视网膜新生血管的重要原因,缺氧诱导视网膜新生血管的生成是常用的复制视网膜新生血管性疾病,特别是研究早产儿视网膜病变的常用方法[1,2]。但是缺氧诱导的视网膜新生血管形成与所采用的动物品系有关。另外有文献报道[3],视网膜色素变性患者及视网膜退行性变模式小鼠很少生成视网膜新生血管,为新生血管疾病的治疗带来了新的希望。早期的工作中,我们实验室发现一种快速视网膜变性小鼠(Retinal degeneration fast,rdf)及两种自发性基因突变模式大鼠,分别为先天性静止性夜盲(congenital stationary night-blindness,CSNB)大鼠[4]和视网膜锥细胞失功能(retinal conedystfunction,RCD)大鼠[5],其在成年时仅主要表现为功能性的改变,而视网膜光感受器则无明显的退行性变化。为进一步探索视网膜新生血管的发生机制,我们参照文献方法[6],对新生的模式动物采用高浓度氧诱导视网膜新生血管制备模型,观察三种模式动物的视网膜新生血管发生特点。 材料和方法 选择清洁级、鼠龄为7d的SD大鼠、CSNB大鼠、RCD大鼠、rdf×C57BL/6J小鼠、rdf×C57BL/6J杂合子小鼠及rdf小鼠各1窝,每窝(即每组) 6只为高氧/复氧实验组,正常对照组为以上6种品系同龄新生鼠各1窝每窝(即每组) 6只。(正常SD大鼠由第四军医大学实验动物中心购买,突变品系动物由第四军医大学航空航天医学系屏障动物实验室提供)。将实验组新生鼠与母鼠共同置于密闭的动物实验氧舱(DWC450-1150型,上海七0一所杨园医用氧舱厂)。氧舱内接入湿化医用纯氧,氧气的流量控制在0.5-0.75L /min,使氧舱内氧浓度保持在80%±2%,氧舱内气压保持为常压。用数字测氧仪(Ceramatec公司生产的Maxo2 Oxygen Analyzer,ModelOM225AE)测量舱内的氧浓度,氧浓度稳定后每间隔2h监测1次,使其始终保持在80%±2%。每天打开氧舱更换垫料、加水、添食1次。在此环境中饲养5d,然后回到正常氧环境下继续饲养5d至第17d。正常对照组新生鼠与母鼠饲养于正常氧环境至第17d。 按Browning等[7]报道的墨汁灌注显色法,各组新生鼠在P18时进行视网膜铺片,即在钟形罩下乙醚吸入深度麻醉,心脏灌注生理盐水及4%多聚甲醛各10ml后,灌注墨汁与明胶水溶液(1:50)混合液,比例为1:2,每只新生鼠灌注3ml,而后迅速取出双侧眼球,固定于4%多聚甲醛中24h,将其中1只眼球在解剖显微镜下去除角膜、晶状体、玻璃体和巩膜。完整剥离视网膜组织,以视乳头为中心做4个放射状切开,将视网膜平铺于挂胶载玻片上,50%甘油封片后在光镜下观察视网膜新生血管发生情况。 取另1只眼放入4%多聚甲醛溶液中4℃固定24h后,去除前节,制作成眼杯。酒精常规梯度脱水、石蜡包埋,切片方向平行于角膜至视乳头的矢状位连续4μm切片,HE染色,光学显微镜下对视网膜血管内皮细胞核进行计数。每只眼球取20张切片,相邻两张间隔30μm,用双盲法计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞数,统计每只眼球每张切片突破内界膜的内皮细胞核数。选取切片时应避开视乳头周围,仅计数与内界膜有联系的血管内皮细胞核数[9]。 各组新生小鼠按以上大鼠做视网膜组织切片的方法一眼做视网膜组织切片,另一眼用免疫组织化学方法,以v-WF因子染色识别血管内皮细胞。(所用一抗、二抗由美国sigma公司提供。)血管内皮细胞胞浆中见棕黄色为阳性。 结果 在正常饲养环境下,RCD大鼠视网膜血管网稀疏,SD大鼠视网膜切片偶见内皮细胞。在高氧/复氧诱导下,各实验组新生鼠视网膜血管正常放射状网络结构受到破坏,结构稀疏,血管迂曲、收缩或扩张,部分血管出现闭塞,可见无灌注区。其中SD大鼠、CSNB大鼠视网膜有出血点,甚至片状出血。组织切片显示除对照组的SD大鼠中偶见突破内界膜的内皮细胞核外,其他5组均未见。实验组中SD大鼠、CSNB大鼠、RCD大鼠、rdf×C57BL/6J小鼠、rdf×C57BL/6J杂合子小鼠和rdf小鼠6种品系中均可见较多的突破内界膜内皮细胞核,计数结果分别为24.10±2.49 , 38.20±10.47 ,68.00±3.06,16.95±5.12,25.52±6.90,29.15±23.79,与同品系的对照组有显著性的差异(P0.01);与不同品系的实验组比较也均有显著性差异(P0.01)。 结论 1、采用高氧/复氧可以成功诱导出大鼠视网膜新生血管。 2、氧诱导的新生大鼠视网膜新生血管与品系有关,视网膜退行性变大鼠仍可诱导出视网膜新生血管,且严重程度可能与感光细胞的功能有关。 3、rdf在高氧/复氧诱导下有视网膜新生血管,与rd1有明显的不同。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R774.1
【参考文献】
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2388432
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