视网膜Nogo氨基末端信号通路的初步研究

发布时间：2019-01-02 13:24

【摘要】： 数目众多的各种先天和后天性疾病可使中枢神经系统受累,而损伤对神经元及其轴突造成的破坏几乎不可逆,因为在中枢神经绝大多数区域内成年哺乳动物几乎没有更换丢失或濒死神经元的能力,而仅有极其微弱的神经纤维修复作用。故此区域内的创伤性或血管性损伤,和因慢性退行性疾病造成的神经元丢失、神经纤维束损伤,破坏神经回路的完整性,将造成长期的功能障碍。中枢神经损伤后的再生修复,特别是在损伤较重,或慢性损伤的情况下,尤为困难。目前的研究普遍认为,中枢神经损伤后再生受限,主要是因为受到了其髓磷脂中Nogo蛋白的抑制。 nogo基因编码三种异构体,Nogo-A,Nogo-B和Nogo-C。三种异构体的羧基端结构相同,由188个氨基酸组成,含有两个长疏水结构域,和位于这两个疏水结构域之间的一个短的66个氨基酸构成的环状结构域,Nogo-66。在多种神经元都有广泛表达的糖蛋白NgR,被认为是Nogo-66结构域的受体。NgR是一种细胞表面GPI链接蛋白,但因缺乏细胞内结构域需要p75或TROY作为共受体介导通过细胞膜的信号转导,后两者均是属于肿瘤坏死因子受体家族的跨膜蛋白。另一共受体,LINGO-1,作为衔接蛋白也是Nogo信号传递过程中所必须的。而另外两种髓磷脂抑制因子,MAG和OMgp对NgR也有很强的亲和力。说明三种不相关的髓磷脂抑制因子,Nogo、MAG和OMgp,经由同一复合受体,并共享相同的细胞内信号途径。虽然目前广为接受Nogo及其受体NgR的相互作用,对成年哺乳动物损伤后中枢神经轴突的再生发挥了主要的抑制作用,但仍有众多的疑问。因为有资料证实脊髓损伤后,NgR基因敲出的小鼠皮质脊髓束神经元仍然不能再生;在不结合NgR的情况下,Nogo-A氨基末端也可抑制神经元轴突的生长。此外,运动神经元NgR的表达很弱,其他脊髓神经元根本不表达。各种初级感受神经元均无NgR的高表达,有些甚至不表达。如果在中枢神经,NgR是Nogo发挥轴突生长抑制作用的基本神经元受体,那么各种神经元NgR显著的表达差异,将限制对Nogo-66生长抑制作用敏感神经元的范围,实际情况又非如此。关于NgR在小脑浦肯野神经元是否表达,以及脊髓中NgR的分布情况也一直存在争议。而中和Nogo-66活性结构域作用仅获得损伤轴突的有限再生,即便2008年及2009年又分别发现了两个新的作用于Nogo-66结构域的受体,PirB和GPR50,使得Nogo发挥轴突生长抑制作用的途径,仍然存在未解之谜。此外,Nogo及其Nogo-66活性结构域经典受体NgR在视觉系统的表达研究也寥寥无几。而视觉系统因具有:视网膜神经解剖明确的,有已被研究较为透彻的七种主要细胞和一条通路;节细胞通过玻璃体腔内注射就能被直接定向;网膜的功能可通过无创定量技术评估;视神经是源于白质中央部分的分离束,在眼眶内就能被接触到;损伤后,节细胞的存活情况和轴突再生的数量易定量;由于其特征性的解剖和功能构成,可通过检测再生节细胞轴突的连接和形态,评估神经塑形和修复后的功能等优势,广泛被用于损伤中枢神经的再生修复研究。因此对视觉通路Nogo及NgR的分布研究,不仅有助于研究中枢神经损伤后的再生修复,对探讨Nogo-NgR作用也有极大的帮助。 2008年Yale大学Hu等对多种细胞的研究结果表明, Nogo-A另一个不同于Nogo-66结构域的活性位点,氨基末端结构域(Nogo氨基末端)极有可能通过整合素对细胞发挥作用,并鉴定出对Nogo氨基末端敏感的整合素为αv,α5,和α4,但在他们的实验中,仅涉及鸡的背根神经节神经元,并未对其他种类神经元进行研究,虽然,整合素αv和α5在CNS是存在广泛表达的,但鸡视网膜中没有整合素α5的表达,而人类的视网膜中没有整合素αv的表达,这些又对Nogo氨基末端信号通路产生了新的疑问。因此,本研究的目的在于,探讨视觉通路Nogo及其Nogo-66活性结构域经典受体NgR的分布情况,为研究中枢神经损伤后的再生修复,及Nogo-NgR作用奠定理论基础;对视网膜Nogo氨基末端是否存在整合素结合位点进行初步探讨,推测是否可能存在新的Nogo信号途径,从而为临床中枢神经损伤后的修复研究提供新的思路。据此,本课题进行了以下两个方面的研究:1、对大鼠双眼视神经横断前后视觉通路中Nogo与NgR的分布及表达的变化进行研究;2、通过共区域化表达、免疫共沉淀等研究,初步探讨了视网膜Nogo氨基末端是否存在整合素结合位点。主要结果与结论如下: 1、在新生大鼠视网膜、外侧膝状体和视皮质区都存在Nogo蛋白及NgR蛋白的表达,这为Nogo蛋白可能参与视觉通路的建立,轴突的塑形、导向提供了证据。由于在没有NgR的情况下,Nogo仍然可发挥相应的作用,例如可直接作用于细胞的内质网,通过调控内质网内钙离子的浓度改变局部微环境影响细胞的迁移、轴突的延长以及对生长锥进行导向。因此在Nogo和NgR共同出现时,Nogo是否一定通过共区域化的NgR发挥作用,尚需进一步的研究。 2、包括视网膜、视神经、视交叉、视束、外侧膝状体和视皮质在内的成年大鼠视觉通路内都存在Nogo和NgR的表达。视束和外侧膝状体在视神经横断伤后Nogo的变化规律相近,伤后升高并保持该高水平直至伤后14d,而两者及视神经的NgR在损伤后的改变相似,基本不发生变化。双眼视神经完全横断后视网膜中几乎观察不到Nogo和NgR的表达。视神经在损伤后Nogo蛋白呈现出逐渐持续升高的趋势。视交叉直到损伤后的14d才观察到有Nogo的减少,而NgR在损伤后就下降并一直保持在此低水平直至伤后14d。视皮质内的Nogo虽然在损伤后会一直较多,但伤后14d的水平要明显低于伤后7d,NgR伤后虽一直较少,但伤后14d较7d相比要显著增多。因此我们推测,在视神经、视束、外侧膝状体由于Nogo和NgR两种蛋白的变化规律似乎和Nogo-NgR作用不冲突,此三个区域内的Nogo有可能部分通过NgR受体发挥作用,而其他区域内Nogo的作用机制可能更加复杂。 3、通过共区域化表达、免疫共沉淀等研究结果表明,在成年哺乳动物的视网膜中,Nogo-A氨基末端结构域,即Nogo氨基末端存在整合素αv的结合位点。这说明Nogo作用的发挥,不仅可通过Nogo-NgR信号途径,还有可能通过整合素αv信号途径。这为治疗成熟神经系统缺陷疾病,开发新的刺激轴突生长和功能恢复的方法提供了新的思路,但Nogo-整合素αv信号途径设想的提出,仍需大量深入的研究。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R774.1

【参考文献】