组蛋白乙酰化在鼻息肉发病机制中作用的研究

发布时间：2019-01-02 14:35

【摘要】：第一部分：组蛋白乙酰化酶/去乙酰化酶活性在鼻息肉中的变化目的：评估组蛋白乙酰化酶(histone acetyltransferases HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetyltransferases HDACs)活性在鼻息肉组织中的变化,并检测HDACs基因在鼻息肉组织中的表达变化。方法：收集2012年6月-2012年11月期间复旦大学附属眼耳鼻喉科医院鼻息肉和正常鼻黏膜组织标本,提取新鲜组织的核蛋白,分别利用HATs和]HDACs活性检测试剂盒检测组织核蛋白HATs和HDACs活性,同时通过免疫组化的方法比较组蛋白乙酰化程度在鼻息肉和正常鼻黏膜中的差异；另外,提取鼻息肉和正常鼻黏膜组织总RNA,利用荧光定量PCR方法检测HDACs基因在鼻息肉和正常鼻黏膜组织表达变化。结果：收集新鲜鼻息肉标本20例,正常鼻黏膜标本6例;成功提取新鲜组织的核蛋白。HATs和HDACs活性检测结果显示在正常鼻黏膜中,HAT/HDAC为1.19±0.33,鼻息肉组织中HAT/HDAC为1.95±0.57(P0.01),提示鼻息肉中存在HAT/HDAC失平衡。HDACs活性检测显示鼻息肉中HDACs活性为0.164±0.07/80ug,明显低于正常鼻黏膜组织HDACs活性(0.35±0.08/80ug)(P0.01),HATs活性未见显著差异；免疫组化结果显示鼻黏膜和鼻息肉组织中黏膜上皮层乙酰化染色阳性,特别是鼻息肉上皮层乙酰化明显增强。实时荧光定量PCR结果提示HDACs基因在鼻息肉组织中表达与正常对照组之间无明显差异(P0.05),提示鼻息肉组织中HDACs活性降低与HDACs基因表达无直接相关性。结论：鼻息肉组织中HDACs活性降低导致蛋白乙酰化增强,HDACs活性降低与HDAC基因的表达无直接相关性,鼻息肉组织中HAT/HDAC平衡向乙酰化增强的方向偏移,提示HAT/HDAC活性改变可能参与了鼻息肉的发生和发展。第二部分：病原微生物对鼻黏膜上皮细胞乙酰化及HDACs基因表达的影响目的：研究外界病原微生物对鼻黏膜上皮细胞乙酰化及HDACs基因表达的影响。方法：取正常鼻黏膜,利用0.01%蛋白酶XIV消化法分离上皮细胞进行体外培养,分别利用细菌脂多糖(Lipopolysaccharides LPS)和聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸Poly (I:C)刺激鼻黏膜上皮细胞,利用CCK-8检测不同浓度的刺激因素对鼻黏膜上皮细胞活性的影响。刺激上皮细胞24h后分别收集细胞上清和细胞总RNA,利用酶联免疫吸附实验(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay ELISA)测定鼻黏膜上皮细胞分泌白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-8(IL-8)的水平反映刺激因素对上皮细胞的激活作用；通过细胞免疫荧光的方法研究LPS和Poly (I:C)的刺激对鼻黏膜上皮细胞乙酰化的影响；提取细胞总RNA,逆转录合成cDNA,利用实时荧光定量PCR检测LPS和poly(I:C)刺激对鼻黏膜上皮细胞HDACs基因表达的影响。结果：利用0.01%蛋白酶XIV消化分离的方法能够成功分离培养鼻黏膜上皮细胞,倒置显微镜下观察见贴壁生长的鼻黏膜上皮细胞呈铺路石样形态；细胞培养约7d后可进行传代培养,传代培养2-3代的上皮细胞依然保持上皮细胞的形态和增殖特性；细胞活性实验显示LPS≥15ug/ml和Poly(I:C)≥25ug/ml会影响鼻黏膜上皮细胞的活性。LPS(10ug/ml)和Poly(I:C)(20ug/ml)刺激鼻黏膜上皮细胞24h后可激活上皮细胞,表现为上皮细胞分泌IL-6和IL-8水平显著升高；细胞免疫荧光结果显示LPS和Poly (I:C)刺激均可引起鼻黏膜上皮细胞乙酰化,刺激所引起的蛋白乙酰化不仅局限在细胞核,细胞浆内亦出现蛋白乙酰化；荧光定量PCR结果显示LPS和Poly (I:C)刺激并未引起HDACs基因表达变化(P0.05)。结论：LPS (10ug/ml)和Poly(I:C)(20ug/ml)刺激24h可导致鼻黏膜上皮细胞蛋白乙酰化增强,引起细胞核蛋白和细胞浆蛋白乙酰化增强。但LPS和Poly (I:C)刺激并未引起HDACs基因表达的变化。第三部分：抑制HDACs活性对鼻黏膜上皮细胞分泌IL-6. IL-8和LL37的影响目的：探讨抑制HDACs活性对鼻黏膜上皮细胞表达IL-6.IL-8和抗菌肽LL37的影响。方法：体外培养鼻黏膜上皮细胞,同时培养下呼吸道上皮细胞系NCI-H292细胞作为平行对照；利用HDACs抑制剂TSA或SB抑制上皮细胞HDACs活性,然后利用Poly (I:C)剌激鼻黏膜上皮细胞,实验分六组：TSA单独刺激组；SB单独刺激组；Poly (I:C)单独刺激组；TSA+Poly (I:C)联合刺激组；SB+Poly (I:C)联合刺激组；上皮细胞单独培养组。刺激24h后收集细胞上清、提取细胞总RNA和细胞总蛋白,利用ELISA检测HDACs抑制剂对不同组鼻黏膜上皮细胞表达IL-6和IL-8水平的影响；利用荧光定量PCR方法检测不同刺激因素对上皮细胞表达抗菌肽LL37的影响；通过western-blot方法分析抑制HDACs活性对LL37蛋白表达的影响。结果：荧光定量PCR的结果显示TSA (200nM)和SB (4mM)能够诱导LL37基因的表达,并且这种促进作用是不依赖于Poly (I:C)的刺激；western-blot的结果显示TSA和SB可诱导NCI-H292细胞LL37蛋白表达增加,而对鼻黏膜上皮细胞LL37蛋白的表达无明显影响；ELISA检测显示TSA或SB作用于上皮细胞后能够显著抑制Poly (I:C)诱导的鼻黏膜上皮细胞IL-6和IL-8的表达。结论：HDACs抑制剂SB和TSA能够直接诱导呼吸道上皮细胞LL37基因的表达,同时可诱导LL37蛋白在下呼吸道黏膜上皮细胞的表达；SB和TSA能够抑制鼻黏膜上皮细胞表达IL-6和IL-8。
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【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R765.25

【共引文献】