CRYAA启动子区单核苷酸多态性及其蛋白质相互作用网络在年龄相关性白内障中的作用研究

发布时间：2019-03-25 12:56

【摘要】：前言白内障是世界首位致盲性眼病。目前,其治疗仍以手术为主,但手术给个人、家庭及社会带来了沉重的负担。因此,深入研究其发病机制,进行早期干预,具有重要的现实和临床意义。αA晶状体蛋白(alpha A crystallin, CRYAA)是晶状体内主要蛋白质之一,对维持晶状体的透明性具有重要作用。它的分子伴侣功能可以防止晶状体内蛋白质变性,保护细胞免受外界环境损伤的刺激、抵抗各种因素导致的细胞凋亡。因此,本研究围绕αA晶状体蛋白,一方面从DNA水平探讨CRYAA基因启动子区单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)与年龄相关性白内障(age-related cataract, ARC)的关系,分析晶状体内CRYAA表达量差异的原因；另一方面从蛋白质水平鉴定CRYAA相互作用的蛋白质,以及其形成的蛋白质相互作用网络在ARC发生发展中所起的作用。第一部分CRYAA启动子区单核苷酸多态性与年龄相关性白内障易感性的关系研究目的晶状体中CRYAA的表达量在ARC患者和对照者中存在差异,而启动子区单核苷酸多态性是影响基因表达的因素之一。因此,本研究探讨CRYAA启动子区单核苷酸多态性与年龄相关性白内障易感性的关系。方法(1)观察CRYAA启动子区单核苷酸多态性与ARC的相关性：研究共纳入243例ARC患者(核性白内障C2NO3P2)和1348例正常对照者(核性白内障C2NO2P2)。采集所有研究对象外周静脉血5ml,提取基因组DNA, PCR扩增CRYAA基因启动子-1--1000区域,对PCR产物进行DNA测序,鉴定CRYAA启动子区SNP位点。通过SHEsis在线分析平台分析ARC组和对照组在等位基因频率和基因型频率上的分布差异,并通过Haplotype分析观察SNP位点之间的协同作用关系。(2)检测SNP对基因表达的影响：合成CRYAA启动子-1--1000区域的DNA序列,将其克隆至pGL3-Basic质粒载体,形成pGL3-Basic-CRYAA载体；根据CRYAA基因启动子区域鉴定结果,使用定点突变技术构建rs7278468的SNP位点突变质粒pGL3-Basic-rs7278468载体,转染至293T细胞,进行双荧光素酶报告基因实验,检测启动子效率。结果CRYAA启动子-1--1000区域共鉴定到6个SNP位点：rs3761381, rs3761382, rs79545821, rs13053109, rs7278468和rs117396767。在等位基因频率分布上,只有rs7278468位点在ARC组和对照组之间均存在显著差异(P0.05),对照组次要等位基因出现频率大于ARC组；在基因型频率分布上,6个SNP位点在ARC组和对照组之间均不存在显著差异(P0.05)。Haplotype分析结果显示：个体出现C-C-G-G-T-C分型是ARC发病的危险因素(P=0.027,OR=1.258),而出现T-C-A-G-G-C是ARC的保护性因素(P=0.038,OR=0.736)。双荧光素酶报告基因检测结果显示SNP位点rs7278468次要等位基因的出现增强了启动子效率,进而细胞内CRYAA表达量上升。结论CRYAA基因启动子区SNP是个体ARC发病风险差异的遗传学基础。单个位点的SNP影响CRYAA的蛋白质表达量。多个SNP位点间的协同作用则对ARC发生发展有着不同的影响：Haplotype分型C-C-G-G-T-C是其危险因素,而Haplotype分型T-C-A-G-G-C是其保护性因素。第二部分CRYAA蛋白质相互作用网络在年龄相关性白内障中的作用研究目的CRYAA分子伴侣功能的本质是蛋白质之间的相互作用,因此本研究通过蛋白芯片的方法鉴定与CRYAA相互作用的蛋白质,分析其蛋白质网络在ARC发展中可能存在的作用。方法 (1)相互作用蛋白质的鉴定：使用含有人类蛋白质组17225个蛋白质的HuProt蛋白芯片鉴定蛋白质相互作用。根据CRYAA的1-173个氨基酸合成CRYAA蛋白质,将4ng/μl的CRYAA与蛋白芯片共同孵育1.5小时(对照组给予PBST溶液),其后分别给予CRYAA一抗(1：1000)和IgG-Cy3标记的二抗(1：200)各孵育1小时。使用Axon GenePix 4000B芯片扫描仪检测阳性信号,读取芯片上每点F532和B532数值,并根据公式计算信噪比(Signal Noise Ratio, SNR): SNR=MeanF532-MeanB532/SDB532。选择SNR≥1.2作为筛选CRYAA相互作用蛋白质的标准。对鉴定到SNR≥1.2的蛋白质,通过Gene Ontology和DAVID网站进行蛋白质生物学功能分析,通过string和KEGG蛋白质组学网络分析蛋白质之间的相互联系,进而建立CRYAA蛋白质相互作用网络,分析CRYAA参与的影响ARC发生发展的生物学进程。(2)选取数个蛋白芯片鉴定到的CRYAA相互作用蛋白质进行细胞内验证：合成CRYAA基因编码区DNA序列,克隆至p3xFlag-CMV-7.1 质粒载体,形成 p3xFlag-CMV-CRYAA质粒载体。将p3xFlag-CMV-CRYAA载体转染至293T细胞,使细胞内表达带有Flag标签的CRYAA。转染24小时后,将全蛋白裂解液与抗Flag的M2 beads共同孵育,从而免疫共沉淀CRYAA与其相互作用蛋白质形成的复合物,经Western blot鉴定此复合物中与CRYAA相互作用的蛋白质。结果对照组共有343个蛋白质信号强度高于CRYAA组,其中127个蛋白质SNR≥1.2。8个CRYAA相互作用蛋白质SNR≥3.0：造血细胞特异性Lyn底物蛋白1 (hematopoietic cell-specific Lyn substrate 1, HCLS1)、Kelch样蛋白6(Kelch domain containin 6, KLHDC6)、肌营养蛋白δ(sarcoglycan delta, SGCD)、KIAA1706蛋白(KIAA1706 protein, KIAA1706)、5’-三磷酸尿苷转移酶(RNA guanylyltransferase and 5'-phosphatase, RNGTT)、10号染色体开放阅读框57 (chromosome 10 open reading frame 57, C10orf57),9号染色体开放阅读框52 (chromosome 9 open reading frame 52, C9orf52)和尿激酶型纤溶酶原激活物受体(plasminogen activator, urokinase receptor, PLAUR)。通过Gene Ontology 和 DAVID网站进行生物信息学分析,发现CRYAA相互作用的蛋白质涉及多种功能类别：磷酸化蛋白(Phosphoprotein)、选择性剪切(Alternative splicing)、DNA结合蛋白(DNA binding)、细胞周期(Cell cycle)、细胞骨架(Cytoskeleton)、线粒体(Mitochondrion)、凋亡(Apoptosis)、蛋白水解(Proteolysis)、细胞对压力的反应(Cellular response to stress)、DNA损伤修复(DNA repair)、自体吞噬(Autophagy)等。选取细胞骨架蛋白质HCLS1、MAPK信号通路蛋白MAPKBP1、MORG1和热休克蛋白HSPB1进行验证,结果显示CRYAA在细胞内与这些蛋白质形成复合物,即通过与这些蛋白质相互作用从而行使其在不同生物学进程中的功能。结论CRYAA与多种蛋白质相互作用从而参与众多生物学功能和进程,维持晶状体的透明性：通过骨架蛋白维持细胞膜稳定,如HCLS1；通过细胞周期蛋白质维持晶状体上皮细胞活力；通过应激反应蛋白质降低氧化损伤的伤害：如HSPB1；通过凋亡通路(MAPK.P13K/AKt信号通路)及DNA损伤修复相关蛋白质抑制细胞凋亡,如MAPKBP1和MORGl；通过泛素化-蛋白酶体及自体吞噬系统促进蛋白质的降解。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R776.1

【相似文献】