快速诊断早期棘阿米巴角膜炎qPCR方法的建立及应用

发布时间：2019-05-06 14:27

【摘要】：目的建立检测棘阿米巴18srDNA的TaqMan探针实时荧光定量PCR(Real-time PCR or qPCR)方法,为无创早期诊断棘阿米巴病提供基因诊断标准方法。方法提取分离自土壤和水中的5株棘阿米巴DNA,测序后与GenBank中搜索到的棘阿米巴67条序列进行比对,在物种保守区域设计Real-time引物和TaqMan探针,通过T克隆载体制作标准品并测序,建立方法的标准曲线,测定最低检测浓度,同时用该方法检测其他病原微生物及临床疑似棘阿米巴角膜炎病人眼分泌物,实验数据通过JMP5.0.1和测评软件进行棘阿米巴角膜炎F检验和诊断测试评估。结果qPCR和培养法检测180例疑似棘阿米巴角膜炎病人眼分泌物,阳性率分别为(5±1)%和(2.9±1.2)%,差异有统计学意义(F=13,P0.01)。以qPCR法测定的标准品CT值为纵坐标(Y),以标本浓度的对数为横坐标(X)建立标准曲线:Y=-3.24X+40.74,R0.99。用建立的qPCR方法测定棘阿米巴18srDNA最低浓度为10拷贝/UL。用qPCR检测其他病原微生物,结果均为阴性。通过诊断测试评估软件比较两种方法检测临床疑似病人眼分泌物结果,95%置信区间内qPCR方法的灵敏度为100%,传统实验室培养法为62.5%。结论棘阿米巴18srDNA Real-time PCR基因检测方法具有无创伤性、高效、特异、经济等特点,适用于疑似棘阿米巴角膜炎病人的筛查。
[Abstract]:Objective to establish a real-time fluorescence quantitative PCR (Real-time PCR or qPCR) with TaqMan probe for the detection of Acanthamoeba 18srDNA in order to provide a standard method for gene diagnosis of Acanthamoeba disease in the early stage of non-invasive diagnosis. Methods five strains of Acanthamoeba DNA, isolated from soil and water were sequenced and compared with 67 sequences of Acanthamoeba isolated from GenBank. Real-time primers and TaqMan probes were designed in the conserved region of the species. The standard sample was made by T clone vector and sequenced, the standard curve of the method was established, and the lowest detection concentration was determined. At the same time, the eye secretion of other pathogenic microorganisms and clinical suspected patients with acanthoamoeba keratitis was detected by this method. The experimental data were evaluated by F-test and diagnostic test of Acanthamoeba keratitis by JMP5.0.1 and evaluation software. Results the positive rates of qPCR and culture were (5 卤1)% and (2.9 卤1.2)%, respectively. The positive rates were (5 卤1)% and (2.9 卤1.2)%, respectively. The difference was statistically significant (F = 13, P0.01). The standard curve was established by qPCR method with the standard sample CT value as longitudinal coordinate (Y), and the logarithm of sample concentration as transverse coordinate (X): Ya, 3.24X 40.74, R _ (0.999). The minimum concentration of Acanthamoeba 18srDNA determined by the established qPCR method is 10 copies / UL. QPCR was used to detect other pathogenic microorganisms, and all the results were negative. The sensitivity of qPCR method was 100% in 95% confidence interval and 62.5% in traditional laboratory culture method by comparing the results of the two methods by diagnostic test and evaluation software. The sensitivity of the two methods was 100% in 95% confidence interval and 62.5% in traditional laboratory culture method. Conclusion Acanthamoeba 18srDNA Real-time PCR gene detection method is non-invasive, efficient, specific and economical, and can be used to screen patients with suspected keratitis of Acanthamoeba.
【作者单位】： 温州医科大学寄生虫教研室;温州医科大学附属眼视光医院检验科;温州医科大学附属二院育英儿童医院新生儿科;
【基金】：浙江省自然科学基金项目(No.Y2080973) 温州市科技局项目(No.Y20090012)
【分类号】：R772.21

【参考文献】

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本文编号：2470245