饱和氢生理盐水对噪声性聋防护作用的分子病理机制研究

发布时间：2019-07-11 16:44

【摘要】：噪声性聋（Noise-induced hearing loss, NIHL）是由强噪声刺激引起内耳毛细胞损伤后所产生的一种感音神经性耳聋。无论在发达国家还是在发展中国家，它都是造成职业性耳聋的主要原因之一。据估计，全球每年约有5亿人面临噪声致聋的风险。这不仅仅是一个健康问题，也是一个严峻的社会问题。噪声致聋的机制主要包括直接的机械损伤和间接的代谢损伤。目前认为，耳蜗内发生氧化应激反应产生大量自由基破坏内耳毛细胞是噪声致聋的一个主要分子机制。基于这一理论，大量抗氧化药物被用于防治噪声性聋的研究。近年来有报道氢气可以选择性清除羟自由基（hydroxyl radical, OH）和过氧亚硝基阴离子（peroxynitrite, ONOOˉ）这两个破坏性最强的自由基，使其成为理想的抗氧化治疗的物质。研究发现，通过应用富含氢气的培养基体外培养毛细胞可以降低氧化应激造成的毛细胞损伤，饮用和腹腔注射富含氢气的生理盐水也均能减轻噪声导致的听力下降和毛细胞的损伤。为了进一步研究氢气制剂对噪声性聋的保护作用及作用机制，本研究通过噪声暴露前豚鼠腹腔注射饱和氢生理盐水的方法，研究氢气对噪声性聋的保护作用，并在病理分子水平研究探索其作用的具体机制。第一部分饱和氢生理盐水预防噪声性听力损伤的研究目的：建立噪声性听力损伤动物模型，验证噪声暴露前腹腔注射饱和氢生理盐水对豚鼠听力的保护作用。方法：Hartley豚鼠随机分为3组：饱和氢生理盐水组，生理盐水组，正常对照组。饱和氢生理盐水组和生理盐水组豚鼠在接受噪声暴露（130dB SPL,1h）前三天每日及噪声暴露前1h分别腹腔注射饱和氢生理盐水和生理盐水（1ml/100g），正常对照组不做任何处理。噪声暴露后，，听性脑干反应（ABR）和畸变耳声发射（DPOAE）检测豚鼠听力下降程度和评估外毛细胞功能。结果：ABR结果显示，饱和氢生理盐水组豚鼠听力下降程度在噪声暴露后即刻至噪声暴露后14天均较生理盐水组低。噪声暴露后第7天和第14天，饱和氢生理盐水组豚鼠DPOAE结果在多个频率上均较生理盐水组改善明显。结论：噪声暴露前腹腔注射饱和氢生理盐水能显著预防噪声导致的豚鼠听力下降和外毛细胞损伤。第二部分饱和氢生理盐水预防噪声损伤耳蜗的病理形态学研究目的：通过噪声前后对豚鼠耳蜗病理形态学的检测，验证饱和氢生理盐水对耳蜗内组织结构的保护作用。方法：分别通过硝酸盐（AgNO3）染色、扫描电镜（Scanning electron microscopy, SEM）、鬼笔环肽（Phalloidin）染色、琥珀酸脱氢酶（Succinate Dehydrogenase, SDH）染色、免疫组化（Immunohistochemical, IHC）染色的方法检测噪声暴露前后豚鼠耳蜗内组织结构的变化。结果：噪声暴露后7天，SDH染色和免疫组化染色显示，饱和氢生理盐水组毛细胞SDH着色较生理盐水组明显深，毛细胞形态也较好，外毛细胞Myosin Ⅶa的显色较生理盐水组清晰。Phalloidin染色显示毛细胞表皮板损伤较生理盐水组轻。噪声暴露后14天，硝酸银染色、扫描电镜显示，饱和氢生理盐水组毛细胞纤毛的损伤、缺失均较生理盐水组明显减轻。结论：豚鼠噪声暴露前腹腔注射饱和氢生理盐水能显著减轻噪声导致的耳蜗内组织结构的损害，对外毛细胞的功能和形态学变化具有显著的保护作用。第三部分饱和氢生理盐水对噪声性聋防护作用的分子机制研究目的：通过检测噪声暴露前后豚鼠耳蜗内自由基、细胞因子和相关蛋白的表达变化情况，探索饱和氢生理盐水发挥作用的具体分子机制。方法：噪声暴露前后，应用比色法和酶联免疫检测的方法检测豚鼠耳蜗内自由基和细胞因子的变化。Western blot方法检测耳蜗内与氧化应激和炎症反应相关调控蛋白表达的变化情况。结果：噪声暴露后即刻，饱和氢生理盐水组豚鼠耳蜗内破坏性自由基脂质过氧化物（LPO）、羟自由基（OH）和丙二醛（MDA），DNA氧化损伤标志物8羟基鸟嘌呤（8-OHdG）以及炎症因子细胞间粘附分子-1（ICAM-1）的含量较生理盐水组明显减少。而在噪声暴露后第7天，饱和氢生理盐水组豚鼠耳蜗内LPO、MDA、白介素（IL-1、IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的含量也较生理盐水组明显为低。噪声暴露后即刻，饱和氢生理盐水组豚鼠耳蜗内磷酸化的P38蛋白（p-P38）的表达较生理盐水组明显减低，而在噪声暴露后第7天，这种表达差异消失。结论：饱和氢生理盐水具有抗氧化、抗炎的作用，其发挥作用，一方面可能是通过直接或间接的清除自由基和炎症介质等细胞因子而起效，另一方面可能是通过调节磷酸化的P38蛋白含量，影响其下游调控的信号通路来起效的。
文内图片：噪声暴露前后ABR阈值的变化

图片说明：图 1-1 噪声暴露前后 ABR 阈值的变化噪声暴露后即刻，饱和氢生理盐水组和生理盐水组豚鼠 ABR 阈值分别为 54.00±3.16 dSPL 和 62.00±4.21 dB SPL，二者差异有统计学意义（P<0.01）。噪声暴露后第 1、3、714 天，饱和氢生理盐水组 ABR 阈值的恢复均较生理盐水组明显。注：Control：空白对照组；HS：饱和氢生理盐水组；NS：生理盐水组；**P<0.01：vs NS##P<0.01：Control vs NS。表 1-1 噪声暴露前后各组豚鼠 ABR 阈值（ x±s, n=10）dB SPL空白对照组饱和氢生理盐水组生理盐水组声暴露前露后即刻露后 1 天露后 3 天露后 7 天露后 14 天19.00±3.1619.50±2.8420.50±2.8420.50±1.5819.50±2.8320.00±3.3315.50±4.3854.00±3.1636.50±9.1434.00±6.5834.50±4.9733.50±6.2616.50±3.6962.00±4.2146.50±8.8346.00±4.5943.50±4.1245.50±6.43
文内图片：噪声暴露前后DPOAE的变化

图片说明： 19图 1-2 噪声暴露前后 DPOAE 的变化前三组豚鼠听力正常，DPOAE 幅值无差异。B：噪声暴露后组豚鼠 DPOAE 幅值在 0.5 ~ 4kHz 之间均较生理盐水组改善明C：噪声暴露后第 14 天，饱和氢生理盐水组豚鼠 DPOAE 幅值率上较生理盐水组改善明显，差异有统计学意义。：空白对照组；HS：饱和氢生理盐水组；NS：生理盐水组；*P.01：HS vs NS。
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R764.43

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