重组低过敏原性粉尘螨过敏原的表达及鉴定

发布时间：2019-07-12 18:51

【摘要】：目的:重组表达粉尘螨的低过敏原性过敏原,为安全高效的脱敏治疗服务。方法:通过大肠杆菌表达含前肽序列的粉尘螨过敏原ProDerf1,通过一系列纯化步骤后,基于过敏病例血清采用ELISA方法比较重组过敏原和天然Derf1的IgE结合活性,以判断其过敏原性强弱。结果:在大肠杆菌高效表达了ProDerf1并获得了大量纯化蛋白,结合试验结果显示重组ProDerf1的IgE结合活性显著降低,显示低过敏原性。结论:经过透析及纯化等步骤后得到的重组粉尘螨过敏原ProDerf1较天然Derf1的过敏原性低,可应用于易于标准化的安全高效的脱敏治疗制剂。
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图片说明： 2. 1　重组表达载体pET-44a/ProDer f 1的鉴定　经PCR初步鉴定, 1 000 bp处有目的条带扩增出来,与目的基因921 bp一致(图1)。用限制性内切酶NdeI和PstI对重组质粒进行双酶切鉴定,得到线性pET-44a质粒和921 bp目的条带两个片段(图2),进一步证实目的基因已经成功构建到pET-44a载体中。测序的结果与原始序列同源性为100%,可以进行下一步的原核表达。图1　重组质粒的PCR鉴定电泳M: DL 2 000 marker; 1-4:ProDerf1基因PCR产物.图2　重组质粒的酶切鉴定电泳M: DL 2 000marker; 1:对照pET-44a质粒; 2-4:重组质粒双酶切产物.2. 2　ProDer f 1在大肠杆菌中的表达　重组质粒pET-44a/ProDer f1转化大肠杆菌RosettaBlueTM后,蛋白质诱导表达结果显示,在相对分子质量(Mr)为35 000出现了1条新的蛋白质表达条带,与预期Mr相符。经分析表达产物占细菌总蛋白的30%,说明带His标签的融合蛋白ProDer f1在大肠杆菌中得到了表达。2. 3　ProDer f 1的分离纯化及W estern blot分析　大量诱导表达融合蛋白质后
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图片说明：用限制性内切酶NdeI和PstI对重组质粒进行双酶切鉴定,得到线性pET-44a质粒和921 bp目的条带两个片段(图2),进一步证实目的基因已经成功构建到pET-44a载体中。测序的结果与原始序列同源性为100%,可以进行下一步的原核表达。图1　重组质粒的PCR鉴定电泳M: DL 2 000 marker; 1-4:ProDerf1基因PCR产物.图2　重组质粒的酶切鉴定电泳M: DL 2 000marker; 1:对照pET-44a质粒; 2-4:重组质粒双酶切产物.2. 2　ProDer f 1在大肠杆菌中的表达　重组质粒pET-44a/ProDer f1转化大肠杆菌RosettaBlueTM后,蛋白质诱导表达结果显示,在相对分子质量(Mr)为35 000出现了1条新的蛋白质表达条带,与预期Mr相符。经分析表达产物占细菌总蛋白的30%,说明带His标签的融合蛋白ProDer f1在大肠杆菌中得到了表达。2. 3　ProDer f 1的分离纯化及W estern blot分析　大量诱导表达融合蛋白质后,离心收集菌体
【作者单位】：暨南大学生命科学技术学院生物工程学系;广州医学院第二附属医院过敏反应与免疫相关疾病研究实验室;
【基金】：国家自然科学基金资助项目(30771240) 国家转基因重大专项课题(2009ZX08011-004B)
【分类号】：R392.8

【共引文献】