间充质干细胞在前房相关免疫偏离中作用的研究

发布时间：2019-08-02 11:33

【摘要】：目的 前房相关免疫偏离(anterior chamber-associated immune deviation, ACAID)是指引入前房内的抗原所诱导出的一种免疫偏离反应,其特征是抗原特异性的Thl免疫应答,如迟发型超敏反应和补体固定性抗体受到抑制,但却保留了非补体固定性抗体,即IgG1亚型的产生。它是角膜特有的免疫赦免机制之一,是角膜植片长期存活的主要因素；能够避免自身免疫性疾病和单疱病毒性基质型角膜炎。间充质干细胞(messenchymal stem cells,MSCs)能够抑制多种免疫细胞(包括T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞以及树突状细胞)的增殖和功能,具有免疫调控和诱导免疫耐受的作用。本研究旨在通过小鼠前房相关免疫偏离动物模型,观察MSCs在前房相关免疫偏离小鼠体内是否能够发挥免疫调控作用,以及其可能的作用机制,为临床治疗角膜移植排斥反应和自身免疫性葡萄膜炎等眼病提供理论依据。 方法 1、人脐带间充质干细胞(hMSCs)的培养和扩增。 2、制作小鼠前房相关免疫偏离动物模型,C57BL/6小鼠随机分为4组,前房相关免疫偏离组(A组)、前房相关免疫偏离+MSCs组(B组),皮下免疫组(C组)和皮下免疫±MSCs组(D组),共4组。A、B两组将2μ1卵白蛋白(OVA,50mg/ml)行前房注射,C、D组予2μ1 PBS前房注射,B、D组前房注射同时给予尾静脉注射1×106/0.2ml MSCs,7d后4组均行足底皮下免疫OVA100μ1(2.5mg/mlOVA与CFA等体积充分乳化)。 3、动物模型制作后14d用工程游标卡尺(精确度为0.01mm)测量4组小鼠双耳廓厚度,然后于小鼠右耳廓皮内注射20μLOVA溶液(20mg/mL),左耳廓皮内注射20μL无菌PBS溶液。24h后,再用工程游标卡尺测量4组小鼠双耳廓厚度,按照下述公式计算耳廓肿胀数值。公式为：迟发型超敏反应耳廓肿胀数值=(24h右耳廓厚度值-Oh右耳廓厚度值)-(24h左耳廓厚度值-Oh左耳廓厚度值)(gm)。 4、取造模后15d各组小鼠脾脏淋巴细胞孵育48h后的上清液,采用ELISA试剂盒测定上清液中IL-10、TGF-β、IFN-γ水平。 5、取造模后15d各组小鼠脾脏淋巴细胞,流式细胞仪测定CD4+CD25+Foxp3+ CD8+Foxp3+调节性T细胞的百分比。 结果 1、hMSCs生长良好,镜下观察细胞长梭形,呈排列紧密的漩涡样结构,培养近5代后,细胞的形态没有发生明显变化,其增殖趋势也保持明显稳定。 2、成功建立小鼠前房相关免疫偏离动物模型。 3、迟发型超敏反应检测：A、B两组的小鼠耳廓肿胀程度远远小于C组(P0.05),证明ACAID造模成功。A、B两组耳廓肿胀程度无差别(P0.05),无统计学意义,C、D两组耳廓肿胀程度无差别(P0.05)。 4、ELISA结果：IL-10 B组较A、C、D组水平升高(P0.05),C与D组之间无统计学意义；TGF-βB组比A、C、D组水平升高(P0.05),D组比C组水平升高(P0.05)；IFN-γB组较A、C、D组水平降低(P0.05),D组比C组水平降低(P0.05)。 5、流式细胞分析结果：B组脾细胞中CD4+CD25+Foxp3+T细胞在CD4+T细胞中的比例和CD8+Foxp3+T细胞在CD8+T细胞中的比例均较A、C、D组升高(P0.05),而C组和D组在这两方面均无统计学意义。 结论 MSCs通过调节Th1/Th2细胞因子的分泌,以及激活或上调调节性T细胞来发挥其免疫抑制作用。本研究证实MSCs可进一步抑制前房相关免疫偏离抗原特异性DTH反应的发生,促进前房相关免疫偏离的免疫耐受状态的维持。从而减小了机体针对抗原产生的免疫反应对眼球的破坏,为角膜移植术后排斥反应及葡萄膜炎的治疗提供了理论依据。
【图文】：

图1工程游标卡尺(精确度0.01mm)胞因子测定模后15d各组小鼠脾脏淋巴细胞孵育48h后的上清液，采用EL清液中IL一10、TGF一6、IFN一Y水平。具体原理、步骤及结果计:木实验采用双抗体夹心ABC一ELISA法。以IL一10为例，用抗小十酶标板上，标准品和样品中的IL一10与单抗结合，加入牛物素一10，形成免疫复合物连接在板卜，辣根过氧化物酶标记的str结合，力[]入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标木中IL一10IFN一Y原理同上。:木:造模后15d，，断髓处死小鼠，75%酒精浸泡20min。净台内无菌取出脾脏，用lmL注射器将脾脏头尾两端各扎一针，

天津医科大学硕士学位论文结3.2.迟发型超敏反应检测表1各组小鼠耳廓肿胀反应数值TablEarswe1lingmeasurementamongthegrouPs分组数量(只)A组(ACAID组)B组(ACAID+MSCs组)C组(皮下免疫组)D组(皮下免疫十MSCs组)平均耳廓厚度(林m)29.22士1‘4128.80士1.4767.33士1.6463.57士1.52<0.05<0.05n村八口n

本文编号：2522090