内耳前体细胞增殖中的信号通路调控机制

发布时间：2019-08-08 16:22

【摘要】：内耳毛细胞很容易受药物、噪音、基因缺陷等因素的影响而受到损伤,导致永久性听力功能障碍或者前庭功能障碍。毛细胞受到损伤后,由于哺乳类动物包括人类的毛细胞自发修复和再生能力有限,而导致听力减退或者前庭功能障碍。激活毛细胞再生,是治疗听力和前庭功能障碍的有效途径。而在非哺乳类的脊椎动物如鸟类,在耳毒性药物或者噪声损伤后,内耳感觉上皮毛细胞可以通过支持细胞的增殖、转分化,而使毛细胞自发再生,最终替代受损的毛细胞,维持和恢复感觉上皮的功能。通常认为,内耳毛细胞和支持细胞具有共同的前体细胞,甚至有研究者认为有些支持细胞是处于某一个特殊分化阶段的毛细胞,当受到所处环境变化如损伤、基因导入等的影响后,可以继续完成向毛细胞的分化。因此支持细胞是目前比较公认的再生毛细胞的前体细胞。所以,对非哺乳脊椎动物的内耳感觉上皮的支持细胞增殖机制的研究,有助于进一步对哺乳动物内耳毛细胞再生的研究。生物的细胞每时每刻都在接受来自细胞内外的各种各样信号,信号转导是生命活动的一种最基本和最重要的方式。信号转导分子的基因突变或表达调控失常、抑制信号转导分子的功能等,都将导致细胞对外界信号反应失控,产生疾病。许多疾病(尤其是肿瘤)的发生和发展与细胞信号转导异常有直接或间接的关系。很多信号通路都参与并调控内耳的发育、感觉细胞的再生等过程;信号通路之间还存在着相互交联(crosstalk)作用,相互之间进行传递和识别,信号分子间相互作用,互相调控和协调着内耳感觉上皮上前体细胞的分裂和毛细胞的分化。感觉前体细胞可以分化成毛细胞或者支持细胞。研究并阐明相关信号通路在内耳感觉前体细胞增殖中的作用和机制,并调控在感觉前体细胞的增殖和分化过程中起着重要作用的相关信号通路,可以为内耳感觉前体细胞的再生提供坚实的理论基础,同时为毛细胞再生提供理想的途径和方法。视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)由Rbl基因编码,Rb在感觉前体细胞的细胞周期和维持早期毛细胞和支持细胞的静止状态中起着重要作用。pRb的功能由磷酸化状态调控,pRb可以通过MEK/ERK和Rb/Raf-1两条信号通路达到磷酸化。此外,Notch和Wnt信号通路均是高度保守的信号传导通路,广泛存在于各种生物体内。Notch信号通路是通过局部细胞间的相互作用控制细胞命运的一种信号通路。Notch信号通路在内耳发育过程中不仅起着侧抑制作用,在早期发育中还起着诱导增殖分化作用]。Wnt信号通路在内耳的发育过程中主要涉及到听板的定向分化、耳蜗管的延伸、感觉细胞的定向分化和细胞极性的调。在内耳中,不但调控着内耳的发育,也可以促进耳蜗的前体细胞发生增殖。且Notch信号通路和Wnt信号通路之间存在着相互交联(crosstalk)作用。pRb在禽类胚胎期耳囊感觉上皮的发育中有着重要的作用,但是在损失后的感觉上皮中前体细胞的增殖和再生中的作用尚不清楚；并且Notch和Wnt信号通路及其相互交联(crosstalk)在内耳前体细胞增殖中的作用尚未知；为研究这些内耳发育相关的信号通路在内耳前体细胞增殖中的作用及其机制,我们研究了pRb在损失后的新生鸡椭圆囊感觉上皮中的前体细胞重新进入细胞周期中的作用,以及Notch和Wnt信号通路在哺乳类动物的内耳感觉前体细胞增殖中的作用及机制；为进一步通过调控相关信号通路,促使哺乳动物内耳毛细胞再生提供新的途径和方法。第一部分pRb在新生鸡椭圆囊前体细胞增殖中的作用[目的] 研究pRb在损失后的新生鸡感觉上皮中的前体细胞重新进入细胞周期,发生增殖中的作用,以及MEK/ERK和Raf-1-Rb两条信号通路在pRb蛋白的磷酸化中的作用和机制。以期在损伤后的哺乳动物感觉上皮中,通过调控pRb使内耳前体细胞重新进入细胞周期而达到毛细胞的再生奠定基础。[方法]本研究通过体外培养新生鸡(P0-P3)椭圆囊,用庆大霉素损伤椭圆囊感觉上皮后,给予5’-溴脱氧尿核苷(BrdU)及MEK/ERK信号通路的阻断剂U0126：该阻断剂可以特异性的阻断MEK/ERK信号通路中的ERK磷酸化；和Rb/Raf-1通路的阻断剂RRD-251：为Rb-Raf-1的分裂子,在体内或体外呈pRb依赖性的有效的抑制血管生成和肿瘤的生长；分析研究其对椭圆囊感觉上皮前体细胞增殖的影响；分别采用realtime PCR的方法检测细胞增殖过程中相关的重要的增殖基因、及信号通路相关基因的表达情况,及western-blot方法分析其蛋白水平的表达变化、及其磷酸化程度的改变情况。[结果] 新生鸡椭圆囊感觉上皮毛细胞被庆大霉素损伤后,毛细胞大量死亡丢失,感觉前体细胞发生大量的自发再生；当给予MEK/ERK信号通路的阻断剂U0126及Rb/Raf-1通路的阻断剂RRD-251后,感觉前体细胞的增殖明显减少,呈剂量依赖性；并且通路相关基因和细胞周期的相关因子基因表达量下降,及MEK/ERK和Rb/Raf-1信号通路的相关蛋白表达下降。[结论]新生鸡的内耳感觉细胞在被损伤后,前体细胞可以大量自发的再生,因此,禽类的内耳感觉细胞是我们研究内耳毛细胞再生的很好的模型。pRb蛋白的磷酸化在新生鸡椭圆囊的感觉前体细胞的增殖中起着重要的作用,MEK/ERK信号通路和Rb/Raf-1信号通路均参与着损失后的新生鸡椭圆囊感觉上皮的pRb磷酸化过程。对于pRb在损伤后的新生鸡椭圆囊前体细胞增殖中的作用的研究,为在损伤后的哺乳动物感觉上皮中,通过调控pRb使内耳前体细胞重新进入细胞周期而达到毛细胞的再生提供了新的途径和方法。第二部分Notch和Wnt信号通路在新生小鼠内耳前体细胞增殖中的作用[目的]研究Notch和Wnt信号通路以及两者的相互交连作用(crosstalk),在新生小鼠内耳前体细胞增殖及再生中的作用;为进一步通过调控Notch或/和Wnt信号通路,促使哺乳动物内耳毛细胞再生奠定新的理论基础和方法。[方法]取新生小鼠(P0-P3)的内耳基底膜行体外培养,给予EdU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine,5-乙炔基-2'-脱氧尿苷)和Notch信号通路的γ-secretase酶抑制剂DAPT或DBZ来抑制Notch信号通路；Wnt信号通路激动剂QS11以激活Wnt/β-catenin信号通路;研究Notch和Wnt信号通路以及两条信号通路的相互交联在正常的以及新霉素损伤后的新生小鼠基底膜上前体细胞增殖和再生中的作用；并用real-time PCR和western-blot方法对信号通路和前体细胞周期相关基因及蛋白表达的变化情况进行检测和分析。[结果]在新生鼠正常和损伤后的感觉上皮上,给予小剂量DAPT抑制Notch通路后,促使感觉细胞区毛细胞明显增多,且感觉细胞区可见大量的细胞发生增殖,可见增殖性再生；单独给予Wnt信号通路激动剂QS11,毛细胞和支持细胞无明显改变,亦未见明显细胞增殖。当同时给予DAPT和QS11后,促使感觉细胞区毛细胞明显增多,可见大量的细胞发生增殖,发生增殖的细胞数量较单独使用Notch信号通路抑制剂DAPT促进增殖的细胞数量更为明显；对相关信号通路及内耳感觉细胞相关基因的表达水平的改变情况进行分析显示：小剂量γ-secretase酶抑制剂抑制Notch信号通路后,可以使其下游基因Hes1下调,当同时用Wnt信号通路激动剂后,上调了Hes1的表达；单独抑制Notch通路和同时抑制Notch并激活Wnt通路,均使Math1、c-myc-2的表达上调。并且在单独使用DAPT或DAPT和QS11同时使用后,β-catenin蛋白的表达量均升高。[结论]小剂量的γ-secretase酶抑制剂抑制Notch信号通路后可以促进内耳感觉前体细胞发生增殖性再生；且Wnt信号通路可以进一步协同促进抑制Notch信号通路引起的感觉前体细胞的增殖性再生；推测是由于Hes1等基因的表达上调,而增强了Wnt/β-catenin信号通路的表达,进一步促进内耳前体细胞的增殖性再生。
【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R764

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