自身免疫反应在青光眼持续性视神经及视网膜节细胞病理损伤中的作用

发布时间：2019-09-10 10:10

【摘要】：第一章青光眼小鼠模型的建立以及视网膜节细胞和视神经损伤评估 目的：建立青光眼小鼠模型,观察小鼠短期眼内压升高以及眼压回复正常基线后的视神经轴索和视网膜节细胞损伤及高眼压引起的自身免疫反应。 方法：18只成年C57BL/6J小鼠接受单侧眼前房注射15μm多苯乙烯微粒,制作单侧眼短期眼压升高模型。对照组为18只前房接受等量PBS注射的同龄C57BL/6J小鼠。分别于实验后2周,4周及8周后处死小鼠。免疫荧光染色和电镜量化评估视神经和视网膜节细胞的损伤；视网膜铺片免疫荧光染色检测T细胞浸润及补体的沉积；Elisa检测外周血清中总工gG以及抗热休克蛋白27的抗体滴度。 结果：1)眼压变化：18只全部接受微粒注射的小鼠18只眼眼压均上升,8天左右达到峰值,维持3周左右,之后眼压回复正常水平。2)视神经轴索及节细胞改变：2周时高眼压眼对比自身对侧眼中视神经轴索数目减少18.2±3.4%；视网膜节细胞减少19.3±4.9%。而2到3周当眼内压回复正常水平后,高眼压组的视神经损伤持续产生。至4周和8周高眼压眼对比自身对侧眼视神经轴索数目分别减少25.8±4.6%和32.8±2.6%；(P0.05)相应的视网膜节细胞数目减少29.9±9.2%和37.3±5.7%。(P0.05)而8周相对4周以及4周相对2周视神经轴索与视网膜节细胞损伤均有显著差异(p0.05)。3)免疫反应-T细胞浸润与补体及抗热休克蛋白：在C57BL/6J高眼压模型小鼠的视网膜中2周至3周左右可检测到T细胞浸润,T细胞出现的时间窗与眼压升高同步。同时还检测到补体在视网膜节细胞中的沉积以及外周血循环中血清总抗体和抗热休克蛋白27抗体的升高。 结论：前房注射微粒可成功诱导C57BL/6J小鼠高眼压,高眼压状态下出现相应的视神经轴索及节细胞损伤,在眼压回复正常之后4到8周之内视神经仍然持续损伤。同时高眼压还可以启动全身免疫反应,这种自身免疫反应可能与高眼压之后视神经持续损伤病理相关。 第二章免疫调节在青光眼持续性视神经及视网膜节细胞损害中的作用 目的：通过检测免疫缺陷转基因小鼠短期高眼压造成的视神经轴索以及视网膜节细胞的损伤,探讨免疫调节在青光眼视神经损害中的作用。 方法：选择成年免疫缺陷的RAGl-/-, BCKO和TCKO小鼠的各6只单侧眼前房注射多苯乙烯微粒；对照组为相同数量的转基因小鼠前房注射PBS。分离并选择性转移24只C57BL/6J高眼压小鼠和24只PBS注射对照组小鼠的CD4+T细胞分别至至12只Ragl-/-高眼压小鼠体内；分别于2周及8周后处死小鼠并对比同时段处死的C57BL／6J高眼压模型小鼠量化评估各组视神经和视网膜节细胞的损伤。 结果：RAGl-/-,BCKO和TCKO小鼠在诱发高眼压后2周时视神经轴索损伤分别为11.9±2.6%,16.6±33%,16.3±3.1%；相应的视网膜节细胞损伤为14.7±3.5%,19.0±3.8%,18.7±5.4%。而高眼压8周时视神经轴索损伤分别为15.2±7.3%,23.8±6.2%,21.7±6.1%；相应的视网膜节细胞损伤为21.3±7.0%,30.6±6.2%,25.3±6.1%。微粒注射组小鼠的CD4+T细胞较对照组可明显促进Ragl-/-高眼压受体小鼠的视神经及视网膜节细胞的损伤(p0.05)。其视神经轴索损伤为24.3±2.4%,相应的视网膜节细胞损伤为23.5±3.1%.而对照组视神经轴索损伤分别为为19.3±3.9%,相应的视网膜节细胞损伤分别为18.5±2.7%。 结论：除Ragl-/-小鼠外,TCKO及BCKO高眼压小鼠在2周时较C57BL/6J高眼压小鼠均无明显神经保护作用。而在8周时3种免疫缺陷小鼠的视神经及视网膜节细胞损伤均显著下降。T细胞和B细胞可能同时都涉及到青光眼高眼压后视神经持续损伤病理机制。而T细胞可能在其中起到了核心作用。而CD4+T细胞与青光眼高眼压后的神经损伤病理有直接关系。 第三章热休克蛋白27在高眼压青光眼持续性病理损伤中的作用 目的：探讨热休克蛋白27在青光眼高眼压小鼠模型的持续视神经病理损伤中的作用。 方法：分别检测1,2,4,8周的高眼压小鼠视网膜热休克蛋白27的表达(每组6只),以及小鼠外周血清总抗体和热休克蛋白27抗体的滴度。并通过皮下注射热休克蛋白100μg抗原联合同体积CFA建立热休克蛋白27超敏小鼠模型。并使用耳缘注射抗原体内检测热休克蛋白27特异性的迟发型超敏反应(DTH)以及体外使用热休克蛋白27刺激培养分离的胰脏淋巴细胞,从而确定该模型的CD4+T细胞对抗原的反应性。选择性转移12只热休克蛋白27超敏小鼠的CD4+T细胞至6只C57BL/6J高眼压小鼠体内,并检测其视神经和视网膜节细胞的损伤。使用同等剂量的OVA蛋白联合同体积的CFA建立OVA超敏小鼠模型,并使用12只OVA超敏小鼠的CD4+T细胞准移至6只C57BL/6J高眼压小鼠作为对照。 结果：短期眼压升高将导致小鼠视网膜热休克蛋白27的表达上调。通过免疫荧光和WB均可检测到该蛋白从眼压上升1周内即有明显表达,而眼压下降之后仍然持续表达至8周。热休克蛋白27超敏小鼠的CD4+T细胞较对照组可明显促进C57BL/6J高眼压小鼠的视神经及视网膜节细胞的损伤(p0.05)。其视神经轴索损伤为35.3±4.6%,相应的视网膜节细胞损伤为34.2±5.2%。而对照组视神经轴索损伤分别为为26.2±5.2%,相应的视网膜节细胞损伤分别为27.4±1.6%。 结论：热休克蛋白27在青光眼高眼压视网膜中将持续表达,其可能通过触发T细胞免疫反应而产生神经元毒性作用。热休克蛋白27特异性致敏的CD4+T细胞对青光眼高眼压视神经持续损伤病理起到了重要作用。 第四章青光眼病人外周血中淋巴细胞对热休克蛋白27的反应 目的：探讨临床青光眼患者外周血淋巴细胞对热休克蛋白27的反应性。 方法：取21例临床青光眼患者以及22例同年龄组的正常人群外周血。通过E1isa检测抗热休克蛋白27的抗体滴度。以及分离培养外周血淋巴细胞,并通过Elispot体外检测外周血淋巴细胞在定量热休克蛋白27的刺激下产生IFN-γ的分泌水平。 结果：临床青光眼患者的外周血清抗热休克蛋白27的抗体滴度较同年龄组的正常人群显著上升27.8±2.5%(p0.05)。青光眼病人的外周血淋巴细胞较年龄配对的正常人群在热休克蛋白27刺激下显示出显著升高55.4±9.4%的IFN-γ分泌水平(p0.05)。 结论：高眼压可以触发全身的自身选择性免疫反应,这种免疫反应有可能在高眼压过后的视神经和视网膜节细胞的持续病理损伤机制中起到重要作用,而热休克蛋白27可能作为诱导这种免疫反应的自身抗原蛋白而成为临床治疗青光眼的新靶点。
【图文】：

1.2.1青光眼小鼠模型的建立2月龄大小的成年C57BL/6)小鼠分为两组，18只接受前房注射直径为15脚的多苯乙烯微粒，从而诱发短期的高眼压(图1，A，B)。图A，为微粒注射后7天后眼球切片，可见微粒聚集于前房角，并堵塞小梁网和Schelm管。从而堵塞房水的流出通道导致眼内压的升高。图B，，为微粒注射14天之后眼球切片，可见聚集于前房角的大部分微粒己排出，或被虹膜及睫状体巨嗜细胞吞噬，机化固定。14天之后

微粒注射组(n=18)对比PBS注射组(n=6)眼内压从注射后第二天起即显著升高(p>0.05)。眼压在1到2周内达峰，峰值约为22mlnHg。3周之后两组眼压值无明显差异(p<0.05)。(图2)一i扭el· osPhereuUeeted PBSuljeeted拜奎乳井扦盆卜共:艳O

本文编号：2533963