糖原合酶激酶3β对青光眼视网膜神经节细胞作用的研究

发布时间：2019-09-14 08:21

【摘要】：随着世界人口的增长，青光眼患者数量也在逐渐增多。青光眼作为全球第二大致盲性眼病，它的治疗受到越来越多的人关注。青光眼是一组以视神经节细胞死亡及视神经轴索变性丢失，，具体表现为视盘凹陷性萎缩及视野缺损的疾病，且损伤不可逆转。因此，青光眼早期治疗上，抵御任何引起视神经节细胞损伤和视神经轴索变性的因素，是我们目前最需要解决的问题。一直以来，青光眼的治疗手段主要依靠降低眼内压，通过降低眼内压力，从而减少压力对视网膜神经节细胞的作用导致的神经细胞死亡。目前对青光眼的认识已不再停留于单纯眼部疾病，更多的讨论青光眼是一种神经退行性疾病。它与多种神经退行性疾病有着相似的病理过程，这为我们进一步研究青光眼的治疗，提供了新的思路。糖原合酶激酶3β（Glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）是目前研究发现在神经退行性疾病发病机制中发挥重要作用的激酶，直接或间接导致神经病理过程的发生发展，如阿尔茨海默氏病中使Tau蛋白过度磷酸化致神经纤维缠结，使Aβ增多致老年斑形成等等，且临床上已有抑制其活性的药物用于治疗神经退行性疾病。本研究分别从体外体内两个方面模拟青光眼高眼压环境建立高眼压模型，即加压培养视网膜神经节细胞建立体外高眼压模型和鼠眼全周巩膜上静脉结扎烧灼联合全周角巩缘毛细血管灼烧术法诱导大鼠慢性高眼压模型。通过对体内体外正常对照，高眼压模型及GSK3β抑制剂氯化锂作用后的模型进行免疫荧光、Western blot等方法检测GSK3β的表达，体外光镜下对细胞的形态学观察，MTT检测吸光度反映细胞活性，体内荧光显微镜下对神经元计数等，研究GSK3β在高眼压模型中对视网膜神经节细胞的作用。本研究共有两部分。第一部分糖原合酶激酶3β对体外加压培养下视网膜神经节细胞作用的研究【目的】研究体外加压培养的视网膜神经节细胞（RGCs）中GSK3β活性变化及其对RGCs细胞存活的影响。【方法】混合培养大鼠视网膜神经节细胞（RGCs），分为RGCs对照组，单纯RGCs加压组（60mmHg压力下培养24h），RGCs中加压+10mmol/L氯化锂（Licl，GSK3β抑制剂）组，RGCs中加压+20mmol/lLicl组。采用免疫荧光方法检测RGCs中磷酸化丝氨酸9位点GSK3β(pS9-GSK3β)的表达情况，MTT检测RGCs细胞活性。【结果】加压组pS9-GSK3β表达的荧光密度(MOD值=0.057 0.012)较对照组(MOD值=0.085 0.023)明显降低(p0.05)，而加压+10mmol/LLicl组和加压+20mmol/L Licl组pS9-GSK3β表达的荧光密度(MOD值分别为0.081 0.016和0.099 0.024)均较加压组(MOD值=0.057 0.012)增大(p0.05)，且随着Licl浓度的增加，pS9-GSK3β表达的荧光密度增大（MOD值20mmol/l Licl=0.099 0.024MOD值10mmol/l Licl=0.081 0.016）(p0.05)。MTT结果显示，加压组细胞活性（OD值=0.109 0.016）较对照组（OD值=0.135 0.015）显著降低（p0.05），而加压+20mmol/LLicl组中细胞活性（OD值=0.159 0.014）较加压组（OD值=0.109 0.016）显著升高（p0.05）。【结论】压力培养下视网膜神经节细胞中pS9-GSK3β表达减少提示GSK3β被激活，RGCs细胞活性减低。Licl作为GSK3β的抑制剂，对RGCs有保护作用。第二部分糖原合酶激酶3β在大鼠慢性高眼压模型视网膜神经节细胞中作用的研究【目的】探讨GSK3β在慢性高眼压模型中对视网膜神经节细胞的作用。【方法】采用鼠眼全周巩膜上静脉结扎烧灼+全周角巩缘毛细血管灼烧术法诱导大鼠慢性高眼压模型，根据高眼压维持时间分成：慢性高眼压2周组和慢性高眼压4周组；每组再由氯化锂作用浓度分为三个小组：单纯慢性高眼压组、2mmol/kg氯化锂慢性高眼压组、3mmol/kg氯化锂慢性高眼压组，同时设立正常对照组，每组8只大鼠。氯化锂组采用每日腹腔注射0.5ml，而正常对照及单纯慢性高眼压模型每日腹腔注射生理盐水0.5ml。慢性高眼压模型术前、术后当天、术后3d、7d、14d、21d、28d监测眼压，眼压稳定在26±2mmHg直至到达规定时间止，每只鼠单侧眼取新鲜视网膜行Western blot检测total-GSK3β及pS9-GSK3β表达量，再灌注固定后另一侧眼行冰冻切片，免疫荧光染色观察视网膜神经节细胞层pS9-GSK3β的表达情况。同时用neun标记视网膜神经节细胞，荧光显微镜下分别对不同分组的视网膜神经节细胞计数。【结果】正常对照和慢性高眼压模型视网膜节细胞层中均表达总GSK3β（t-GSK3β）。正常对照组视网膜节细胞层pS9-GSK3β表达较慢性高眼压模型组增多（p0.01），慢性高眼压2周组较慢性高眼压4周组pS9-GSK3β表达减少(p0.01)。视网膜节细胞数目在正常组较慢性高眼压模型组多(p0.01)，且随高眼压作用时间延长，节细胞数目减少(p0.01)。同一时间段氯化锂作用组视网膜神经节细胞层pS9-GSK3β表达量较单纯高眼压组增多，视网膜神经节细胞数目增多，且随着氯化锂浓度的增加，pS9-GSK3β表达量增多(p0.01)，视网膜神经节细胞数目也增多(p0.05)。【结论】在慢性高眼压模型鼠眼中,GSK3β活化，氯化锂作为GSK3β的抑制剂可以增加pS9-GSK3β的量，使GSK3β活性下降，对视网膜节细胞有保护作用。
【图文】：

图 1 观察各组R G Cs 的 p S9 -G S K 3 β表达情况（ b a r： 2 0μ m ）A 对照组； B 加压组；C 加压+ 1 0 mm o l /l L i c l 组； D 加压 +2 0 mm o l/ l Li c l 组※p < 0 . 0 5 vs B 组，* p <0 . 0 5 vs C 组 /D 组，* * p <0 . 0 5 vs D 组表 1 不同组 R GC s 的活性情况（ x ± s）

视网膜神经节细胞,眼压,网膜

co n t ro l 图 2 各组视网膜神经节细胞数量观察（N e u n ，b a r： 1 0 0μ m ）A 对照组； B1 高眼压 2 w 组； B2 高眼压 2 w +l i c l 2 mm o l/ k g 组；B3 高眼压 2 w +l i c l 3 mm o l/ k g组； C 1 高眼压 4 w 组；C 2 高眼压 4 w +l i c l 2 mm o l/ k g组； C 3 高眼压 4 w +l i c l 3 mm o l/ k g 组。箭头所指为视网膜神经节细胞， # p <0 . 01 vs B1 /C 1 ，同时间组*p <0 . 0 1 vs B2 B3 /C 2 C 3 ， ** p < 0 . 0 5 vs B3 /C 3 。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R775

【参考文献】