保留软骨的去细胞全喉支架的实验研究

发布时间：2019-09-17 13:33

【摘要】：进展期喉癌或者下咽癌的患者常需实施全喉切除术，导致患者言语功能和吞咽功能受损。全喉切术后患者由于无法与人正常交流，常产生自卑，抑郁，焦虑的情绪，45%的全喉切除术后患者具有抑郁症状，远高于其他癌症患者。随着头颈外科手术技术的提高，放化疗的应用，喉癌的5年生存率逐年提高，喉癌的治疗重点应从单纯的追求提高患者生存率向提高患者的生存质量转变，要同时注重恢复和重建患者的全喉功能，提高患者的社会参与性和生活质量。全喉功能的重建成为喉癌术后患者和严重喉损伤患者最热切的临床治疗需要。喉是由软骨，肌肉，黏膜，腺体组成的复合器官，目前传统的手术治疗方法无法完成全喉组织的重建。喉移植是目前对于全喉切除术后患者和严重喉损伤患者唯一有效的重建方法。全世界第一例全喉移植手术于1998年成功实施，移植喉可以为患者提供近似正常的发音，吞咽和呼吸功能。据报道有75%的喉癌切除术后患者愿意接受喉移植手术。然而第一例喉移植患者系严重喉损伤患者，为了避免免疫排斥，在移植术后的12年中长期服用免疫抑制剂。免疫抑制剂的应用常会导致感染，肿瘤复发或转移，大大限制了喉移植在喉癌术后患者身上的使用。由于喉解剖结构的特殊性，目前没有任何一种天然的或者人工合成的材料能够模拟人喉的结构。组织工程学的研究为器官重建提供了新的思路，去细胞同种异体或者异种心脏，肺脏，肝脏支架的构建为组织工程器官提供新的支架结构。去细胞方法可构建出具有天然三维结构的支架，该支架复合种子细胞可构建出具有一定功能的组织或者器官。浸泡法构建的去细胞人喉支架已有报道，该种方法构建的组织工程气管已有移植报道，但是运用该种去细胞方法构建的支架会提高支架的顺应性，导致喉或气管支架软化，甚至导致移植术后喉气管狭窄。喉的支撑结构主要在于喉软骨基质成份。喉软骨细胞具有合成和分泌软骨基质和胶原纤维的能力，因此喉软骨细胞的活性对于维持喉支架的三维框架结构至关重要。软骨是没有血管，没有神经的组织。软骨细胞主要通过基质的渗透作用吸收营养物质。软骨细胞被软骨基质严密包裹这样就避免了软骨细胞与外界的抗原物质相接触。因此通过血管灌注能够去除喉组织中高免疫原性的组织而较好的保留软骨细胞的活性。直接的同种异体移植如果不使用免疫抑制剂会导致严重的免疫排斥反应。主要组织相容性抗原（MHC）的表达是导致免疫排斥反应的主要原因。在对人喉主要组织相容性抗原的研究发现人喉主要组织相容性抗原分布于黏膜上皮层，黏膜下腺和软骨膜，软骨基质中不表达主要组织相容性抗原，软骨组织在同种异体移植中不会引起免疫排斥反应。本研究通过靶控麻醉泵向离体喉的颈外动脉中持续灌注去离子剂构建保留喉软骨活性的全喉支架。支架大体观察，组织学观察，显微结构观察，DNA含量分析，软骨细胞活性检测，支架免疫原性检测研究通过灌注法制备出结构完整，无免疫原性的全喉软骨三维支架的可行性；将去细胞全喉软骨支架埋植到受体大网膜内检测受体对支架的大体反应情况和淋巴细胞浸润情况，研究去细胞全喉软骨支架的生物相容性和免疫原性。将骨髓间充质干细胞体外培养扩增后种植到去细胞全喉软骨支架上，观察细胞在支架上的生长情况，证明支架的毒性和细胞相容性，细胞标记物示踪骨髓间充质干细胞在支架上的生长情况，为构建组织工程全喉提供理论依据。第一部分保留软骨的去细胞全喉支架的体外研究目的：通过靶控麻醉泵灌注去细胞液构建保留软骨的去细胞全喉支架，对支架进行体外研究，探索制备组织工程喉支架的可行性。方法：实验动物雄性SD大鼠，体重200g左右，随机分为实验组和对照组，实验组分离颈总动脉，结扎分支，经颈总动脉通过靶控麻醉泵向甲状腺上动脉和甲状腺下动脉内持续灌注肝素生理盐水，1%SDS，1%Triton X-100，PBS等溶液；对照组，将喉组织从体内取出喉，不做任何处理，置于含青链霉素的PBS液中与实验组灌注等长的时间。所得标本行大体观察，组织学观察，扫描电镜观察，DNA含量分子检测，软骨活力检测，免疫学检测。结果：全喉的去细胞灌注实验证明通过14h去细胞灌注处理后，全喉大体结构完整，喉组织颜色苍白透明，体积无明显变化，硬度无明显改变，喉的三维结构无明显改变。全喉支架去细胞后除软骨组织中的细胞外，其他组织如肌肉，黏膜，腺体等软组织中的细胞成份基本上被去除，去细胞彻底，效果明显。细胞外的基质成份被完整保留，组织结构清楚，层次分明。组织中的细胞成份基本上被去除，但全喉细胞外基质成份之间的网状连接依然存在，胶原束和细胞外基质成份组成的不规则腔隙存在于喉的会厌，声带，环状软骨，甲状软骨等表面。PCR实验结果显示，不含软骨成份的去细胞支架中几乎无GAPDH基因的扩增，而含软骨成份的去细胞软骨支架GAPDH基因的扩增远低于正常喉组织GAPDH基因的扩增。去细胞后甲状软骨，环状软骨中活的细胞并未见明显变化，组织绝大多数细胞处于成活状态，与对照组无显著差异。去细胞全喉基质成份MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ染色阴性。结论：通过靶控麻醉泵持续给喉的双侧颈总动脉泵入去污剂，可以在较好的保留软骨细胞活性的同时去除喉肌肉，黏膜，腺体等组织中的细胞，构建出完整的全喉软骨框架结构，该支架的具有良好三维框架结构，较低的免疫原性和较好的机械力学结构，可作为全喉缺损修复的理想支架材料。第二部分保留软骨的去细胞全喉支架的体内研究目的：将去细胞全喉软骨支架植入同种异体受体动物腹腔内，观察受体对支架的反应，探讨支架的免疫原性和生物相容性。方法：实验组将供体BN大鼠的离体喉按照实验一的制备方法经颈总动脉灌注后构建成去细胞全喉软骨支架，将支架埋植到受体SD大鼠的大网膜内；对照组将供体BN大鼠的离体喉不做任何处理直接埋植到受体SD大鼠的大网膜内；实验组和对照组于埋植后2周，4周，8周，12周后取出埋植的标本行大体观察，HE染色观察，CD3+T细胞和CD8+T细胞免疫组化观察。结果：对照组和实验组各组动物均存活至各观察时间点，动物一般状况良好，伤口愈合良好，，无明显的伤口裂开，渗血，溢脓等情况。所有的对照组均引起了强烈的免疫排斥反应，对照组喉被大网膜形成的纤维组织严密包裹，持续的炎性刺激使得纤维膜变得很厚。对照组可见大量的淋巴细胞增生，黏膜，腺体，肌肉，软骨组织受到了不同程度度破坏。CD8+T细胞和CD3+T细胞在各观察点的细胞数量在正常喉埋植后明显高于去细胞全喉软骨支架埋植体内后。去细胞喉支架埋植体内后并未引起强烈的免疫排斥反应。至各观察点取出包埋的喉支架发现，去细胞喉支架仅被薄层的大网膜包裹，未见明显的急性或慢性炎性反应。去细胞喉支架埋植体内4周后可见新生血管形成和成纤维样细胞增生。结论：灌注法构建的去细胞全喉软骨支架埋植于同种异体大鼠的腹腔中，未引起强烈的免疫排斥反应，同时又有新生血管和成纤维样细胞的生成说明去细胞全喉软骨支架具有较好的生物相容性，能促进组织和器官的再生。第三部分去细胞全喉软骨支架的再细胞化研究目的：研究体外培养扩增骨髓间充质干细胞的方法，将骨髓间充质干细胞种植到去细胞支架表面，观察细胞在支架表面的生长情况，探讨去细胞全喉软骨支架再细胞化的可行性。方法：采用密度梯度离心法结合差速贴壁法获取大鼠骨髓间充质干细胞，经免疫细胞化学法鉴定后，用去细胞全喉软骨支架的浸提液培养骨髓间充质干细胞，观察细胞的生长情况，了解支架的毒性。用CM-Dil标记的骨髓干细胞后以1×106的密度将骨髓间充质干细胞种植到支架的环甲肌，环勺后肌，声带等脱细胞基质中，完全培养基，37℃，5%二氧化碳中培养3天，5天，7天后生物显微镜，荧光显微镜，扫描电镜下观察细胞在支架上的生长情况。结果：培养3代的骨髓间充质干细胞，细胞增殖速度快，传代的细胞形态较均一，大多数呈梭形，漩涡生长，保持良好的生长状态。免疫细胞化学结果显示CD29，CD44表达阳性，且阳性率大于90%，此结果符合骨髓间充质干细胞的鉴定标准。细胞可在支架的浸提液中正常生长。经过DM-DIl标记后，骨髓间充质干细胞的阳性标记率几乎可达到100%，将标记后的骨髓间充质干细胞种植到支架上，可见细胞分散在支架表面，但细胞分布成团状或者点状。去细胞全喉软骨支架种植骨髓干细胞后，组织学可见细胞主要生长于喉支架的内侧和外侧表面，细胞生长状态良好，分布均匀。扫描电镜结果显示，骨髓间充质干细胞种植到支架上3天可见少量细胞在支架上生长，相互之间伸出胞突，5天后可见细胞成片状分布在支架表面，7天后，支架表面形成了一层膜状结构，铺满整个支架。结论：通过密度梯度离心法结合差速贴壁法培养，可获得纯化的骨髓间充质干细胞。将骨髓间充质干细胞种植到去细胞全喉软骨支架上可见细胞在支架上正常生长和增殖，提示支架是无毒的不会导致细胞死亡或者突变，支架材料与细胞支架具有良好的亲和性，去细胞支架具有较好的生物相容性。骨髓间充质干细胞可作为组织工程喉的种子细胞。
【图文】：

组织学结构,机构,成份

全喉大体结构完整，喉组织颜色苍白透明，体积无明显变化，硬度无明显改变，喉的三维结构无明显改变（图1.A）。对照组喉支架颜色鲜红，结构完整，肌肉、黏膜、软骨等组织结构完整（图1.B）。3.1.2 组织学观察全喉支架去细胞后除软骨组织中的细胞外，其他组织如肌肉，黏膜，腺体等软组织中的细胞成份基本上被去除，去细胞彻底，效果明显。细胞外的基质成份被完整保留，组织结构清楚，层次分明（图 1.C）。正常组织中，肌肉，黏膜，腺体，软骨中的细胞和组织保留完整（图 1.D）。Masson 染色显示去细胞全喉支架中细胞成份被去除，而细胞外基质中的胶原成份被保留下来（图 1.E）。正常喉组织中肌肉组织完整红染，肌纤维结构清晰，可见软组织中的胶原成份蓝染（图 1.F）。荧光显微镜显示去细胞支架中除软骨组织外，其它组织中细胞成份几乎被去除（图 G），对照组中细胞均匀分散于各种组织中（图 H）。3.1.3 扫描电镜观察去细胞喉支架的扫描电镜结果显示

平均含量,软骨,成份,含量检测

第四军医大学博士学位论文3.1.4 DNA 含量检测去细胞灌注后，不含软骨的去细胞支架中 DNA 平均含量仅为正常喉组织的0.92%。去细胞组织中 DNA 平均含量为 4.56ng/mg,正常组织中 DNA 平均含量为492.96ng/mg。含软骨的去细胞软骨组织中平均 DNA 含量为 82.56ng/mg。PCR 实验结果显示，不含软骨成份的去细胞支架中几乎无 GAPDH 基因的扩增，而含软骨成份的去细胞软骨支架 GAPDH 基因的扩增远低于正常喉组织 GAPDH 基因的扩增（P＜0.05；图 2）
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R739.65

【参考文献】