RNAi介导survivin抑制鼻咽癌CNE-2裸鼠移植瘤的实验研究

发布时间：2019-10-02 05:56

【摘要】：第一部分靶向鼻咽癌survivinshRNA质粒表达载体的构建鉴定目的构建pSIREN-survivin/shRNA重组质粒并测序鉴定,为探索鼻咽癌基因治疗的RNA干扰(RNAi)奠定基础。材料与方法根据基因库survivin cDNA序列(NM_001168)及Reynolds设计原则,设计并合成两端有酶切位点的65个碱基的寡核苷酸链,退火成互补双链后用T4DNA酶克隆至线性化的RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express质粒中；转化大肠杆菌DH-5a菌株,提取质粒行酶切鉴定,测序分析。结果PCR扩增片断与预期结果相符；双酶切证实重组载体构建成功,插入片断测序结果与合成的寡核苷酸序列一致。结论成功构建重组质粒pSIREN-survivin/shRNA,为下一步用脂质体包装并转鼻咽癌组织细胞的研究打下基础。第二部分小分子干扰RNA抑制survivin基因表达诱导鼻咽癌CNE-2凋亡的研究目的观察应用小分子干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)技术抑制鼻咽癌CNE-2细胞survivin表达对细胞凋亡和增殖的影响。材料与方法设计、合成特异性抑制survivin表达的shRNA,转染CNE-2细胞,半定量RT-PCR检测转染后细胞内survivin mRNA变化,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率,MTT检测细胞的增殖。结果质粒转染效率约为(46.9±1.55)%；转染阳性质粒组24h survivinmRNA和蛋白抑制率分别为：(41.58±0.63)%、(68.29±0.52)%；48h抑制率分别增至(63.64±0.96)%、(70.83±0.48)%；阳性质粒转染组24h凋亡率为(36.24±0.78)%,48h增加至(50.37±0.85)%,显著高于阴性对照组和未处理组,阳性质粒转染组S期细胞减少,G2/M期所占比例增高,出现了G2/M期的阻滞现象；MTT显示阳性质粒转染组细胞的生长减缓。结论特异性shRNA可以有效干扰鼻咽癌细胞内survivin mRNA和蛋白的表达,诱导细胞的凋亡和抑制细胞的增殖。第三部分RNAi介导survivin抑制鼻咽癌CNE-2裸鼠移植瘤的实验研究目的探讨靶向survivin基因的短发卡RNA (short hairpin RNA, shRNA)对人鼻咽癌CNE2裸鼠移植瘤生长的影响。材料与方法构建裸鼠荷瘤模型,通过瘤内多点注射、脂质体转染质粒,测定肿瘤生长体积、用半定量RT-PCR和免疫组化测定survivin mRNA和蛋白的表达,用透射电镜检测survivin shRNA对细胞凋亡的影响并对裸鼠肝肾功进行检测。结果survivin基因序列特异shRNA能有效而稳定地抑制鼻咽癌移植瘤survivin mRNA和蛋白的表达；显著抑制肿瘤组织的生长,促进细胞凋亡,并对裸鼠肝肾功能短期无影响。结论RNAi技术能有效抑制鼻咽癌移植瘤survivin的表达,降低鼻咽癌细胞的增殖能力,促进鼻咽癌细胞凋亡,减缓移植瘤的生长。
【图文】：

示意图,示意图,链连接,缓慢冷却

心%户勺图1一 2sllRNA产生示意图2.3将目的基因寡核昔酸链连接到质粒载体2.3.1目的基因片段的退火1)将己合成的两条shRNA模板链分别稀释到大约2林g乍L。2)按照下表加入至50林L的退火体系中混匀，将各管置于94℃的水浴锅中smin，表l一3退火体系寡核普酸体积01190一senseZ林L01190一antisenseZ林L 0.05MHEPES46林L然后让其缓慢冷却至室温，冷却速度约0.5℃/min，产物置于一20‘C冰箱保存。3)各取l卜L退火产物加99林LHZO做 100倍稀释备用2.3.2稀释退火片段分别与线性化质粒表达载体的连接其中短目的片断与线性载体的物质的量比为3:1，，22℃反应过夜。表1一4连接体系退火后的 ds011901林LPSIREN一DNR一DsRED一ExPressl林L10xbufferl林LT4DNA连接酶l林LddHZO6林L

菌落PCR,产物,重组质粒

465bp大小的目的基因条带，表明质粒初步构建成功。(其中4、5、7未见条带，考虑未转化成功)，右侧为阴性组，两组均出现465bp大小的目的基因条带。如图1一3 M:oLZ000DNAm叭 er2000bp、 1000bp、 750bpsoobp、 250bp、 1oobp;一8为pCR产物图1一3菌落PCR产物2重组质粒凝胶电泳1%琼脂糖凝胶电泳，所示片段分子大小为6.74Okb与设计的重组质粒分子大小一致。如图1一4 M:SuPercoiledDNALadderMarker11849、10085、8023、6133、5026、3997、3049、ZO87bP;1:阳性质粒2:阴性质粒图1一4重组质粒凝胶电泳结果3.重组载体的酶切鉴定将重组质粒psIREN一survivi眺hRNA分别进行EcoRI和BamHI单、双酶切电泳(图1一5)。因重组质粒插入片断分别含有Eco斑和BamHI酶切位点，可被分别切开成单一线性片断，也可被同时切开成为大小两个线性片断，图中可见，单酶切的质粒长度不变，但比同样大小的环状质粒电泳速度慢而在上方;而双酶切可见下方约65如的目的基因条带，而空的白质粒
【学位授予单位】：昆明医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R739.63

【引证文献】