单核细胞上调RPE细胞的SDF-1生成促进实验性脉络膜新生血管的血管发生

发布时间：2019-10-24 08:39

【摘要】： 研究背景脉络膜新生血管(CNV),为多发于黄斑部视网膜下的新生血管膜,易因出血、渗出及瘢痕形成而致盲。其形成包含血管生成(angiogenesis)和血管发生(vasculogenesis)两个形式。CNV是多种致盲性眼后节疾病的共同病理基础,尤其是年龄相关性黄斑变性(AMD),是目前西方国家中老年人群致盲的首要原因,且AMD患者中90%是因CNV致盲的。我国新生血管性AMD的发病率高于国际平均水平,而随着中国老龄化程度的加重,这一问题也将成为我国的一大社会问题。如何防治CNV是当前眼科学研究的重要课题。目前对于CNV和AMD的病因学和发病机理还不清楚。最近的研究提示AMD很可能是一种眼内免疫炎症反应驱动的疾病。以往研究显示巨噬细胞(Mφ)普遍存在于CNV中,可能发挥着重要的作用,但是具体是如何作用的尚不清楚。考虑到Mφ可能是免疫炎症反应的中心环节,研究Mφ在CNV发生发展中的作用和作用机制将有助于我们更好的理解CNV的发病机理,并可能为寻找新的治疗办法提供契机。 目的探讨单核巨噬细胞(MC/Mφ)在实验性CNV中对血管发生的作用和作用机制 方法清除MC/Mφ有效性检测:采用C57BL/6J小鼠尾静脉注射脂质体包裹的氯屈膦酸盐(clodronate-lip)清除MC/Mφ,脾脏组织免疫组化检测Mφ数量(F4/80标识);药物毒性检测:制作DiO标记的脂质体,尾静脉注射小鼠体内后,免疫荧光染色检测视网膜色素上皮(RPE)细胞、内皮细胞(EC)和Mφ与脂质体的位置关系。体外脂质体与RPE细胞和猴脉络膜-视网膜内皮(RF/6A)细胞共培养,MTT法检测细胞增殖活性改变,ELISA检测培养上清中血管内皮生长因子(VEGF)及基质细胞衍生因子α(SDF-1α)水平;清除MC/Mφ对CNV的影响:将年轻(6~8周)绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠的骨髓细胞移植给经Co60照射的成年野生型C57BL/6J小鼠(6~8wk)建立嵌合体小鼠,532nm激光光凝诱发嵌合体小鼠CNV。实验组小鼠静脉注射clodronate-lip清除全身MC/Mφ,同时设注射空脂质体(PBS-lip)小鼠为空载体对照组以及注射PBS小鼠为正常对照组。脉络膜铺片观察激光后3d和2w时激光斑处表达GFP的细胞量和CNV面积,组织切片免疫荧光染色观察激光后3d激光斑局部血管内皮生长因子(VEGF)和基质细胞衍生因子-1(SDF-1)表达量以及2wk时CNVQgGFP细胞分化为EC(CD31标识)和平滑肌细胞(SMC,α-SMA标识)的细胞量;另观察移植老年( 18月)GFP骨髓的年轻C57小鼠清除MC/Mφ后3d和2wk时GFP细胞量和CNV面积改变。原代分离人单核细胞(MC),接触共培养或采用Millicell小室非接触共培养人RPE细胞和MC,PCR和ELISA检测RPE细胞和培养上清表达SDF-1和VEGF的mRNA和蛋白水平变化。 结果静脉注射clodronate-lip后可有效清除小鼠脾脏中的MC/Mφ;脂质体在激光斑处主要为Mφ吞噬,无明显RPE细胞和EC吞噬脂质体现象。MTT显示与脂质体共培养的RPE和RF/6A细胞增殖能力无改变,分泌VEGF和SDF-1α无降低;嵌合体小鼠嵌合率 90%,接受年轻骨髓移植的小鼠,MC/Mφ清除后激光后3d激光斑处表达GFP细胞面积和比例明显减少,2wk时CNVQgGFP细胞和CNV面积明显减小。空载体对照组和正常对照组间无明显差别。进一步发现,较之空载体组,3d时VEGF和SDF-1表达显著下降,2wk时嵌入CNV内的GFP细胞明显减少,并且分化为EC和SMC细胞的GFP细胞明显减少。接受老年骨髓移植的年轻小鼠清除MC/Mφ后在激光后3d和2wk时GFP细胞数量和CNV面积也显著减小。新鲜分离的MC和RPE细胞共培养4h后可刺激RPE细胞SDF-1 mRNA水平明显升高,RPE细胞基础状态下SDF-1α水平在检测线下,共培养4h和24h时上清中SDF-1α蛋白水平明显高于Millicell非接触共培养的MC和RPE细胞的培养上清液中SDF-1α水平;而细胞共培养没有上调VEGF mRNA和蛋白的表达水平。 结论全身清除MC/Mφ可减轻小鼠CNV生成的严重程度,减少骨髓来源细胞参与CNV的发生,此过程中伴随激光后局部VEGF和SDF-1表达水平下降,可能是这一抑制现象的原因之一;MC可能主要通过与RPE接触后刺激RPE产生SDF-1而促进CNV中的血管发生,而CNV发展中VEGF的改变则可能是一种伴随或者下游表现。
【图文】：

3.2 单核细胞纯度对单个核细胞SSC分析可看到，细胞主要分两群，，分别为位于靠右上的MC群和下方的淋巴细胞群；流式分析显示MC纯度约为70-80%（图3-1）。图3-1 新鲜分离的单核细胞CD14流式检测：显示为73.13%的阳性率3.3 ELISA检测SDF-1α和VEGF3.3.1 标准品曲线和浓度方程SDF-1α：y = -61.72+1281.47x-1616.9x2+511.28x371相关博士学位论文 2011年 第06期 医药卫生科技辑 E073-7-68

B）4h 2050030003500pEGF(Vg/ml)RPEmonocyte-RPElymphocyte-RPE4h 24h***RPEmonocyte-RPElymphocyte-RPEmonocyte/RPE*A 3-3 ELISA 检测 SDF-1α及 VEGF 统计柱状图。RPE：单独培养；monocyte-R细胞与 RPE 接触共培养；lymphocyte-RPE：淋巴细胞与 RPE 接触共培nocyte/RPE：Millicell 小室隔离共培养。*P<0.05AB
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R774.5

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本文编号：2552474