LBH基因沉默调控NP69细胞周期进展机制的研究

发布时间：2019-11-21 16:08

【摘要】：应用抑制性消减杂交和差异筛选法,并结合生物信息学的分析,克隆到鼻咽癌组织中表达下调的新基因LBH。前期转基因研究证实LBH基因表达能抑制鼻咽癌细胞的增殖,初步确定其功能与抑制细胞周期进展有关。为进一步明确LBH基因的作用及机制,本课题以正常鼻咽上皮细胞NP69为模型,采用基因沉默技术探讨LBH基因沉默对细胞周期的影响及相应的分子机制。目的: 以LBH基因正常表达的人鼻咽上皮细胞NP69为模型,通过基因沉默技术使LBH表达下调,阐明LBH基因沉默调控细胞周期的分子机制。方法: 1.设计、合成实验组和对照组小分子干扰RNA(siRNA),转染NP69细胞,使LBH基因沉默,采用Real-Time quantitative PCR技术检测不同浓度siRNA转染后LBH基因表达,优化获得LBH基因沉默最佳效果的条件; 2.利用流式细胞术(Flow cytometry)检测LBH基因沉默对NP69细胞周期的影响; 3.通过Real-Time quantitative PCR、Western Blot技术检测细胞周期相关基因mRNA及蛋白表达,初步确定LBH基因沉默对细胞周期调控的分子机制; 4.进一步采用双报道系统探讨LBH基因沉默对NF-κB和Cyclin D1转录活性的影响,从而研究细胞周期相关基因调控机理。结果: 1.通过对LBH基因表达水平的检测,相对对照组,30nM siRNA转染NP69细胞48h后即可获得最好的LBH基因沉默效果,沉默效率达到91%; 2.流式细胞仪检测结果显示:对照组中G1期和S期的细胞分别占总细胞数的49.94%和49.75%,LBH基因沉默组中G1期和S期细胞的比例分别为44.40%和54.17%,表现为G1减少及S期增加的特点; 3. NP69细胞中Cyclin E2基因在LBH-siRNA转染48h后,其相对表达量相对对照组上调95%,Cyclin E1基因相对表达量无明显变化; 4. Western检测结果显示:LBH-siRNA转染组中c-Myc、Cyclin E2、p-Rb、Rb蛋白表达上调,而Cdc25A蛋白表达无明显差别; 5.荧光素酶测定表明:LBH-siRNA转染48h和72h后,NF-κB转录活性相应上调358%和230%,Cyclin D1转录活性相应上调407%和349%。结论: 1.靶向于LBH基因的LBH-siRNA能有效沉默NP69细胞中LBH基因的表达; LBH基因沉默通过上调细胞周期G1-S期R点的一个关键的周期蛋白Cyclin E2表达促进了NP69细胞G1-S期的进展。LBH基因沉默后,c-Myc、P-Rb、Rb蛋白表达上调,而Cdc25A蛋白表达无变化,由此推测LBH基因沉默通过C-Myc上调Cyclin E2的表达,进而激活下游效应分子P-Rb、Rb,最终促进NP69细胞周期G1-S期进展,Cdc25A可能没有参与c-Myc对Cyclin E2的调控。 2. LBH基因沉默通过上调NF-κB的转录活性,从而上调C-Myc,Cyclin D1最终促进G1-S期细胞周期的进展。
【学位授予单位】：广州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R739.63

【参考文献】