Capn4在鼻咽癌恶性生物学行为中的作用与机制
发布时间：2020-01-19 20:18
【摘要】：鼻咽癌是起源于鼻咽上皮细胞的恶性肿瘤，发病率具有明显的地域分布特征，在东南亚地区和中国南方有极高的发病率，年发病率为20~30/10万。根据国际癌症研究署的全球恶性肿瘤的统计数据显示2008年新发鼻咽癌病人超过84,000人，其中80%在亚洲，5%在欧洲。病因学研究显示鼻咽癌的发生与EB病毒感染、种族背景、饮食习惯、喝酒和环境因素相关。现在，随着影像诊断、放疗技术的进步和联合放化疗的应用，使鼻咽癌局部病灶得到更好的控制。然而，多数鼻咽癌患者在初次诊断时已为晚期，其治疗效果还不尽如人意，III期和IV期患者的5年生存率分别为53%~80%、28%~61%。因此，努力更好地理解肿瘤发生发展的分子机制，寻找新的特异性治疗靶点，在鼻咽癌早期诊断、个体化治疗治疗、预后中显得尤为重要。 Calpain是Ca2+依赖的半胱氨酸蛋白水解酶家族。至今，在人类已鉴定14个家族成员，大部分成员与细胞粘附相关，参与细胞的伸展、迁移、增殖、细胞周期的的调控和凋亡等。Capn4（又称为Capn4S1）是calpain蛋白的一个小分子调节亚基，在调节calpain的稳定性和活性中发挥着至关重要的作用。多项研究表明Capn4的缺失引起calpain-1和calpain-2功能障碍。在转基因小鼠中的研究显示敲除Capn4基因可显著降低calpain活性，从而影响小鼠的正常发育，导致胚胎早期死亡；Knockdown Capn4降低成纤维细胞的迁移和粘附能力。最近的研究报道Capn4在肝细胞癌和肝内胆管上皮细胞癌中高表达，而且Capn4表达程度与患者的预后密切相关。干扰Capn4的表达能够显著降低肝细胞癌和肝内胆管上皮细胞癌的细胞侵袭和迁移能力。由此，推测Capn4在转移癌的细胞迁移和粘附中发挥一定的作用，其在鼻咽癌的发生发展过程中是否发挥类似的作用尚不清楚。 【目的】 1、研究Capn4在鼻咽癌中的表达情况，及与临床病理学特征的关系；2、探讨Capn4在鼻咽癌发生发展中的作用及潜在的分子机制。 【方法】 1、分别应用RT-PCR和Western-blot方法检测Capn4在新鲜活检鼻咽癌组织及鼻咽癌细胞系中的mRNA和蛋白表达水平；2、免疫组化分析Capn4在鼻咽癌组织中的表达及统计学分析其与临床病理学特征的关系；3、构建Capn4siRNA，应用transwell实验和裸鼠尾静脉注射转移实验分析Capn4对鼻咽癌细胞系5-8F、CNE2体内外侵袭和转移能力的影响；4、Western blot分析Capn4对转移相关基因表达的影响；6、分别应用RT-PCR和明胶酶谱法分析MMP2的mRNA表达情况和酶活性；7、上调、下调MMP2的表达，transwell实验观察MMP2对Capn4调节鼻咽癌细胞侵袭转移的影响；8、Western blot分析NF-κB p65的磷酸化情况；9、细胞增殖实验、平板克隆实验、裸鼠体内成瘤实验分析Capn4对鼻咽癌细胞在体内外增殖能力的影响；10、流式细胞仪分析Capn4对鼻咽癌细胞周期的影响；11、Western blot分析Capn4对细胞周期相关调控蛋白的影响。 【结果】 1、Capn4在鼻咽癌组织中的表达显著高于正常鼻咽组织 无论是在mRNA水平还是在蛋白水平，新鲜细针穿刺活检鼻咽癌组织（7例）中的Capn4表达要明显高于正常鼻咽组织（2例）。同样，Capn4在鼻咽癌细胞系5-8F,、CNE2、6-10B的表达明显高于永生化的正常鼻咽上皮细胞系NP69。我们进一步扩大样本量收集了183例的石蜡组织，其中153例鼻咽癌组织，30例非癌鼻咽组织，应用免疫组化进行检测分析。结果显示Capn4在鼻咽癌组织中的表达高于非癌鼻咽组织，差异具有统计学意义(P㩳0.001)。统计分析结果显示Capn4的表达强度与EB病毒感染、鼻咽癌组织的浸润深度、分化程度、TNM分期及是否发生远处转移、淋巴结转移相关。即EB病毒感染者Capn4阳性表达率高于无EB病毒感染；肿瘤分化程度越高，Capn4的阳性表达率越低；肿瘤分期越晚，Capn4的阳性表达率越高；出现远处及淋巴结转移的阳性表达率要明显高于未转移的，差异均具有统计学意义(P＜0.01)。Kaplan Meier生存期分析显示Capn4在鼻咽癌中表达的程度与鼻咽癌患者的预后密切相关，Capn4高表达的患者总生存期、无进展生存期均低于低表达者(P=0.002, P=0.003)。 2、下调Capn4的表达能够在体内外降低鼻咽癌细胞的转移、侵袭能力 我们成功构建了两对Capn4小干扰RNA (Capn4/siRNA-1andCapn4/siRNA-2)，稳定转染5-8F、CNE2鼻咽癌细胞系。RT-PCR和Western blot分析显示与对照细胞相比，转染Capn4/siRNA-1、 Capn4/siRNA-2的细胞内Capn4mRNA和蛋白表达水平均明显降低。Transwell和裸鼠体内转移实验在体内外证实转染Capn4/siRNA细胞的转移、侵袭能力显著低于对照细胞，结果显示：对照组出现7/10例肝肺转移，而注射转染Capn4/siRNA细胞的裸鼠只出现1/10的肝转移和2/10例的肺转移。 3、Capn4通过上调MMP2的表达促进鼻咽癌细胞的转移 为深入研究Capn4调节鼻咽癌细胞转移、侵袭的分子机制，Western blot结果表明siRNA下调Capn4的表达能够引起MMP2、Snail和Vimentin的低表达，E-cadherin的高表达，但对MMP9、N-cadherin和β-catenin的表达没有影响。RT-PCR进一步证实转染Capn4/siRNA能引起鼻咽癌细胞内MMP2mRNA表达的下调；明胶酶谱检测MMP2的酶活性也显示在5-8F、CNE2两个细胞系内下调Capn4的表达均能引起MMP2酶活性的降低。为了确定Capn4是否是通过诱导MMP2的表达来调节鼻咽癌细胞的迁移和侵袭，我们首先应用siRNA技术下调鼻咽癌细胞系MMP2的表达，然后观察细胞的迁移和侵袭能力，实验结果显示：下调MMP2的表达能引起5-8F、CNE2细胞的迁移和侵袭能力下降，且其下降程度与siRNACapn4细胞相似，差异无统计学意义。最后我们在抑制鼻咽癌细胞内Capn4表达的基础上，过表达MMP2的表达，观察细胞的迁移和侵袭能力，结果显示：在5-8F、CNE2细胞系中外源性过表达MMP2后均能够恢复siRNACapn4所引起的细胞迁移和侵袭能力的下降。 4、Capn4调节MMP2的表达是通过NF-κB的活化 有研究报道在肝细胞癌中NF-κB是Capn4促细胞转移的下游效应分子，，此外，在即往的多个研究中发现NF-κB能够上调MMP2的表达来促进肿瘤细胞的转移。因此，我们就设想Capn4在鼻咽癌细胞系中上调MMP2的表达是否也是通过活化NF-κB来完成的。Western blotting分析显示siRNA下调Capn4的表达后能显著降低细胞内NF-κB p65的磷酸化；相反，外源性的过表达Capn4后能增加细胞内NF-κB p65的磷酸化。最后我们应用NF-κB抑制剂helenalin抑制NF-κB的活性，观察细胞内MMP2的表达变化，结果显示不管是过表达Capn4还是knockdownCapn4，细胞在应用helenalin抑制剂后，细胞内MMP2的表达水平与对照细胞相比，均有明显的下降，该结果表明抑制NF-κB的活性能够抑制Capn4对MMP2表达的诱导。 5、体内外实验证实Capn4促进鼻咽癌细胞的增殖 Western blot分析显示与亲本细胞及对照细胞相比，5-8F/siRNA、CNE2/siRNA细胞内的细胞增殖标志PCNA蛋白的表达明显降低。紧接着，我们应用CCK8实验进一步观察Capn4对鼻咽癌细胞体外增殖能力的影响，下调Capn4的表达可使鼻咽癌细胞5-8F、CNE2生长能力下降，与亲本细胞相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。平板克隆实验结果同样显示：与转染空载体的对照细胞系相比，转染小干扰RNA的5-8F、CNE2细胞其克隆形成数明显下降(P 0.05)。我们进一步观察下调Capn4的表达对鼻咽癌细胞裸鼠体内成瘤的影响，与注射转染空载体5-8F/Control细胞相比，注射5-8F/siRNA1细胞的裸鼠体内肿瘤增长相对缓慢，肿瘤体积明显小于对照组（P＜0.05)，具有统计学意义。提取裸鼠体内移植瘤的蛋白组织行Western-blot分析，结果显示：第六周时，转染小干扰RNA在体内仍可有效地抑制细胞内Capn4的表达。 6、抑制Capn4的表达能够阻滞鼻咽癌细胞周期进展 为进一步探讨Capn4促进鼻咽癌细胞增殖的分子机制，我们应用流式细胞术检测细胞DNA的含量，结果显示：与对照5-8F/Control细胞（51.2±1.1%）相比，稳定转染Capn4/siRNA1和Capn4/siRNA2的鼻咽癌细胞5-8F G1期DNA含量（68.5±1.7%；60.7±1.3%）明显增加，S期DNA含量明显减少，P＜0.05。为了进一步观察Capn4影响鼻咽癌细胞的增殖能力，是否是通过调节细胞周期相关调控分子的表达。我们应用Western blot检测了细胞周期相关分子CyclinD1、CyclinD2、CyclinE、CDK2、CDK4、P27、P57、P21的表达情况，结果显示：下调Capn4的表达，引起CyclinD1、CyclinD2、CyclinE的表达降低和P27表达的增多，而CDK2、CDK4、P57、P21的表达没有变化。 【结论】 1、Capn4在鼻咽癌组织中的表达要显著高于正常鼻咽组织，Capn4在鼻咽癌组织中的表达水平与EB病毒的感染、组织的分化程度、TNM分期、肿瘤的体积以及是否出现淋巴结和远处转移呈正相关；2、用小干扰RNA下调Capn4的表达可以明显抑制鼻咽癌细胞转移、侵袭、增殖和成瘤能力；3、Capn4促进鼻咽癌细胞的转移、侵袭，可能是依赖NF-κB信号通路上调MMP2的表达来实现；4、抑制Capn4的表达可以阻止鼻咽癌细胞由G1期向S期进展，使细胞停滞于G0/1期，其潜在的机制可能是部分通过下调Cyclin D1、Cyclin D2和Cyclin E，上调p27来实现。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.63
本文编号：2571202
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.63
【参考文献】
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本文编号：2571202
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