锰型过氧化物酶与鼻咽癌放射敏感关系研究

发布时间：2020-03-05 06:12

【摘要】： 背景鼻咽癌流行于中国南方。低分化型是鼻咽癌最常见的病理组织型,对放射治疗敏感。常规放射治疗是鼻咽癌最常用和最有效的治疗。但是鼻咽癌五年生存率仅为50%左右,而失败主要原因是鼻咽癌组织对放射线的抵抗。增加照射剂量,因会引起周围组织的损害而受到限制。因此,提高疗效只能从增加肿瘤而不增加周围组织的辐射量,或者提高肿瘤组织相对于周围组织的放射敏感性入手。前者涉及改善放疗物理因素。后者涉及探索影响肿瘤与正常组织不同放疗差别的生物因素。步入分子医学时代,诸如免疫疗法和RNA干扰等靶向目标分子治疗等走向应用。对于鼻咽癌治疗,发现和应用有潜力的放射敏感相关生物分子更有意义。受离子辐射的细胞会产生自由基,起辐射诱导细胞毒作用。而锰型过氧化物酶(SOD2)则能歧化超氧阴离子自由基,降低哺乳动物细胞对放射的敏感性。研究目的实验探索锰型过氧化物酶对鼻咽癌放射抵抗性的影响及其作用机制。研究方法①应用集落形成实验检测鼻咽癌细胞株CNE1和CNE2放射前和不同剂量放射后的存活分数,应用多靶单击模型和线性二次模型拟合放射存活曲线,测算放射生物学参数D0,Dq,α,β和SF2,比较两细胞株的放射敏感性。 ②应用水溶四氮唑盐微孔板实验测定细胞株CNE1与CNE2的总SOD和SOD2活性,测评SOD活性和SOD2活性与鼻咽癌细胞株放疗敏感或抵抗的关系。 ③应用Western blot检测照射前和不同时间及不同剂量照射后细胞株CNE1和CNE2的SOD2蛋白表达,测评SOD2蛋白表达与鼻咽癌细胞株放疗敏感或抵抗的关系和随辐射剂量时间的变化。 ⑤使用Gateway(?)-adapted expression vector构建表达miRNA对SOD2基因RNA干扰的质粒。 ⑥采用脂质体转染法将构建的针对SOD2基因的miRNA干扰的质粒转染CNE1细胞,cck-8实验和FCM检测转染质粒对细胞增殖和细胞周期的影响。Western blot和RT-PCR检测瞬转细胞的SOD2的蛋白和mRNA表达变化。 ⑦应用杀稻瘟素(Blasticidin)筛选转染细胞,建立针对SOD2基因表达miRNA干扰的CNE1细胞株,检测稳转细胞的SOD2的蛋白和mRNA表达情况。 ⑧集落形成实验等测算和比较稳转SOD2基因沉默细胞的放射生物学参数,直接测评SOD2对鼻咽癌细胞放射抵抗的影响。 ⑨x-线2Gy和4Gy辐射接受miRNA沉默SOD2基因治疗的CNE1细胞实验,测算细胞生存率,测评基因治疗对鼻咽癌细胞放射增敏作用。结果①鼻咽癌细胞株放射生物学参数在CNE1和CNE2两细胞株放射生存曲线上,每一放射剂量点CNE1的细胞存活分数都高于CNE2。在放射敏感参数D0、Dq、SF2、α和MID CNE1与CNE2相比的分别为：高出50.97%、高出2.31倍、高出1.67倍、少3.35倍,P0.05。 ②鼻咽癌细胞CNE1与CNE2的SOD活性和SOD2活性在总SOD活性和SOD2活性水平细胞株CNE1比CNE2分别高出：63.69%和49.36%,P0.05。 ③鼻咽癌细胞CNE1与CNE2的SOD2蛋白表达细胞株CNE1的SOD2蛋白表达量是CNE2的量的1.94倍,P0.05。受辐射,CNE1细胞的SOD2蛋白量增加(P0.05),但是不随时间和剂量变化(P0.05); CNE2细胞的SOD2蛋白量变化不明显(P0.05)。 ④构建靶向SOD2的miRNA载体质粒与转染CNE1细胞经过质粒DNA测序,质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-imR-SOD2(411、424和700)构建成功。质粒转染鼻咽癌细胞CNE1,经检测EmGFP编码绿色荧光蛋白,转染成功。转染的细胞imR-SOD2411、imR-SOD2424、imR-SOD2700与未转染的细胞相比,SOD2的mRNA分别下调37%、52.19%、45.12%,P0.05; SOD2蛋白分别下调13.43%、51.76%、41.36%,P0.05。转染质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-imR-SOD2424抑制细胞增殖生长25.87%,质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-imR-SOD2700和阴性质粒抑制16.88%和17.15%。转染质粒对细胞周期影响不明显(P0.05)。 ⑤建立沉默SOD2的稳定转染细胞株经抗生素筛选获得稳定转染质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-imR-SOD2700的CNE1细胞克隆。稳转imR-SOD2700的CNE1细胞与未转染的CNE1细胞相比,SOD2的mRNA分别下调72.18%,P0.01; SOD2蛋白分别下调69.95%,P0.05。 ⑥沉默SOD2基因表达细胞放射生物学参数与基因治疗实验在放射生存曲线上,稳转质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-imR-SOD2700的CNE1细胞与无转染的CNE1细胞相比每一放射剂量的生存分数减小,在放射生物参数SF2、D0、α前者比后者分别降低12.81倍、降低2.43、升高2.68倍,P0.05。 ⑦通过沉默SOD2基因-放射增敏治疗实验接受基因治疗敲除SOD2基因的CNE1细胞与未受干扰的CNE1细胞照射2Gy和4Gy的x-线细胞的生存率,基因治疗的CNE1细胞比未受治疗的CNE1细胞分别降低2.53倍和3.72倍。结论鼻咽癌细胞株CNE1相比CNE2的放射抵抗性高。SOD和SOD2活性与鼻咽癌细胞株的放射抵抗有关,活性高的细胞的放射抵抗性大。SOD2蛋白表达与鼻咽癌细胞株的放射抵抗有关,蛋白表达高的细胞的放射抵抗性大。构建靶向SOD2的质粒,能够表达miRNA,下调SOD2基因表达,其中针对SOD2基因位点700至721的niRNA最有效。miRNA沉默SOD2的稳转细胞,SOD2基因mRNA和蛋白显著下调,放射抵抗变弱。总之,miRNA干扰沉默SOD2基因疗法可以应用于放疗抵抗的鼻咽癌,能使癌症放疗的放射敏感性增高。
【图文】：

放射生物学,细胞

值(0.881士0.132)是CNEZ细胞D。值(0.266士0.125)的3.31倍。而系数值小反映细胞抵抗性大的指标:CNEZ细胞的a值(0.763士0.100)是CNEI细胞a值(0.228士0.070)的3.35倍，两株细胞放射参数比较示意图见图2.3。表明CNEI细胞较CNEZ细胞的放射抵抗性强。C视l 0101.10存活分效 0246放射荆t(衍) 810图 2.LCNEI与CNEZ放射生物学图(多靶单击模型)表2.2:CNEI、CNEZ细胞存活曲线参数细胞株CNEICNEZDo(Gy)日(Gy一2)D。(Gy) 0.403士0.(X)5 0.151士0.(X)2 1.398士0.130 0.926士0.068。(Gy一i) 0.228土0.070 0.763士0.100 0.104士0. 0.066士0.037以80.881土0.1320.266士0.125t值P值44.90<0.0001 3.2060 0.0185 4.382() 0.0()47 0.6183 0.5591 3.3710 0.015092.5讨论判断一个细胞是否被放射治疗杀死，要看它是否丧失无限增殖能力。测评细胞是否丧失无限增殖潜能最常用是克隆或集落形成实验143]，是因为存活细胞具有“集落形成能的“金标准””或144]。“克隆”能力。集落形成是放射实验测定细胞被辐射后增殖潜由此实验绘制的生长曲线是最常用于测定并很好反映人细胞

机理,高水溶性,甲月替

实验利用高水溶性四氮哇盐(wST-l)被超氧阴离子还原生成水溶性甲月替过程，呈现黄色至紫色，可用450lun光栅酶标仪检测。O犷还原WST-1效率与黄嚓吟氧化酶活性有线性关系，还原过程能被SOD抑制，原理见图3.1，，因此，能用比色的方法检测SOD活性50%的抑制浓度。图3.1:SOD活性检浏的机理各组450nm光波吸收平均值见表3.1。
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R739.63

【参考文献】