【摘要】： 【研究背景与目的】 鼻咽癌是我国常见的恶性肿瘤之一,在我国南方地区尤为高发,由于鼻咽部解剖位置的特殊性及鼻咽癌细胞对射线较为敏感的特点,目前放射治疗被认为是首选的治疗手段,一直以来,常规分割放射治疗作为鼻咽癌及其它恶性肿瘤的放射治疗方法在临床上己得到公认,而且也得到了比较好的临床治疗结果,但部分患者放疗后未控或局部复发导致鼻咽癌常规放疗失败。、已有较多的临床研究认为鼻咽癌常规分割放射治疗失败的原因为放疗中存在肿瘤细胞加速再增殖,故研究其机制,寻找克服放疗中肿瘤细胞加速再增殖途径是提高肿瘤局部控制率的一大关键。 已有研究证实,细胞受照射后其增殖活性的改变与细胞周期基因有关。为了探索鼻咽癌常规放疗中肿瘤细胞加速增殖的机制,本课题组前期已应用不同的实验方法对鼻咽低分化鳞癌细胞株(CNE2)在连续分割照射中的细胞增殖状态进行研究,明确了CNE2细胞株在连续分割照射中确实存在中后期加速再增殖现象,同时应用基因芯片技术、实时荧光定量PCR筛选出与照射后CNE2细胞株增殖状态相关的差异基因：CDC25A、CUL5、p21、DDA3、CCNG1、ABL1、CDKN1A、CKS2、CCNE1、CDC2、CDKN2C、CCND3等,CUL5为细胞增殖活性增高时显著上调的基因之一,其在照射增殖活性最高时相与最低时相表达差异在2倍以上,因此笔者选择CUL5作为开展功能研究的目的基因。本研究通过离体细胞实验的方法,采用RNA干扰(RNAi)技术抑制CUL5基因的表达,探索CUL5基因表达情况对鼻咽癌放射治疗中细胞增殖活性的影响。 RNAi是近年来迅速发展的基因阻断技术,其可通过双链RNA的介导特异性降解靶mRNA,从而抑制或阻断目的基因表达。该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。目前RNAi方法的应用在肿瘤放射治疗领域主要集中在放疗增敏方面,本研究利用RNAi技术的特异性、高效性、自身无细胞毒性等基本特点,直接对CNE2细胞株进行CUL5基因功能研究,探讨出CUL5在连续分割照射下鼻咽癌细胞加速再增殖现象中所起的作用,为初步探明鼻咽癌常规放疗中肿瘤细胞加速增殖的分子生物学机制奠定基础。 【研究方法】 1.构建、培养稳定抑制CUL5基因表达的细胞株：构建重组质粒pGPU6/GFP/Neo-CUL5,以阳离子脂质体法转染入CNE2中,经过G418毒性实验及阳性克隆有限稀释法筛选、培养出抑制CUL5表达的鼻咽癌细胞株CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5。 2.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)在mRNA水平上验证照射前、后所构建细胞株CUL5基因的干扰效果。 3.四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)及流式细胞术(FCM)检测在60Co-γ线,2Gy/d,连续5d的照射下细胞株的生长增殖变化情况。 【研究结果】 1.构建了重组质粒pGPU6/GFP/Neo-CUL5,经酶切及测序鉴定符合要求；经转染、筛选、培养,培育出CUL5表达抑制的鼻咽癌细胞株CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5及阴性对照细胞株CNE2-pGPU6/GFP/Neo-NC。 2. RT-PCR检测鼻咽癌细胞CUL5基因的表达情况,通过凝胶成像系统分析电泳条带,以β-actin为内参校正,测定空白对照组(CNE2组)、阴性对照组(CNE2-pGPU6/GFP/Neo-NC组)、实验组(CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5组)CUL5的灰度比,照射前各组分别为0.122、0.175、0.004,实验组CUL5基因表达受到明显抑制；照射第1、3、5天实验组CUL5基因表达较对照组仍受到明显抑制。 3.MTT法检测表明：连续分割照射5d期间,CNE2组及CNE2-pGPU6/GFP/Neo-NC组细胞以第3天增殖率最高(分别为122.4%,120.7%),CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5组第1天增殖率最高(103%),3组均以第5天最低。 流式细胞术检测表明：CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5组在连续分割照射第1天增殖速度最快(SPF值=29.35,PI值=43.32),后逐渐下降,第5天增殖最慢(SPF值=15.47,PI值=25.32)；CNE2组第3天增殖速度最快(SPF值=35.34,PI值=50.69),第5天增殖最慢(SPF值=19.35,PI值=30.67)。两组比较,CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5组增殖速度减慢且未出现加速增殖现象。 【研究结论】 1.成功培育出CUL5表达抑制的鼻咽癌细胞株CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5及阴性对照细胞株CNE2-pGPU6/GFP/Neo-NC。 2. CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5细胞无论是在照射前(即未照射)还是在照射后,CUL5的表达均下调,说明对CUL5的干扰作用有效且稳定。 3. CNE2-pGPU6/GFP/Neo-CUL5细胞在连续分割照射5d期间的生长增殖速度减慢,且呈逐天下降趋势,说明抑制CUL5表达后,鼻咽癌照射加速再增殖现象有所改变,这将为寻找鼻咽癌基因治疗的靶点、研究靶向治疗药物提供实验基础和理论依据。
【图文】：
siRNA下调最明显，可作为构建CULS干扰RNA真核细胞表达载体的靶点。in5改LUa压CPPPD盆DP盆 bbbb.nLUonUnUn“0几U60孙40劝2010图1一5Figl一5CULS基因表达的电泳结果 ExPressionsofC毛 JLSafterthetransfeetionofsiRNAsM:6OODNAMarker;1:CULS一669;2:CULS一 1190;3:CULS一2039;4:阴性对照(NC)图1一6CULS基因与内参的灰度比Figl一 6GreysealesofCULSandB一aetin2.2重组质粒的鉴定2.2.1重组质粒的酶切鉴定酶切结果表明，所有质粒均为阳性重组载体(图1一7)。(注:空质粒上带有BamHI、Pstl、Bb:工3个酶切位点。Pstl的位置介于Bb:I和BamHI之间，插入目的基因片段后，Pstl酶切位点被取代，故不能被Pstl所酶切。鉴定时用BamHI，Pstl分别酶切，Pstl酶切结果显示有2条带，
siRNA下调最明显，可作为构建CULS干扰RNA真核细胞表达载体的靶点。in5改LUa压CPPPD盆DP盆 bbbb.nLUonUnUn“0几U60孙40劝2010图1一5Figl一5CULS基因表达的电泳结果 ExPressionsofC毛 JLSafterthetransfeetionofsiRNAsM:6OODNAMarker;1:CULS一669;2:CULS一 1190;3:CULS一2039;4:阴性对照(NC)图1一6CULS基因与内参的灰度比Figl一 6GreysealesofCULSandB一aetin2.2重组质粒的鉴定2.2.1重组质粒的酶切鉴定酶切结果表明，所有质粒均为阳性重组载体(图1一7)。(注:空质粒上带有BamHI、Pstl、Bb:工3个酶切位点。Pstl的位置介于Bb:I和BamHI之间，，插入目的基因片段后，Pstl酶切位点被取代，故不能被Pstl所酶切。鉴定时用BamHI，Pstl分别酶切，Pstl酶切结果显示有2条带，
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R739.63
【参考文献】
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本文编号：
2585574
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