【摘要】：第一部分miR-632在喉癌组织及细胞中的表达水平及其对喉癌细胞Hep-2生物学特性的影响目的:本部分旨在研究miR-632在喉癌组织及细胞中的表达及其对喉癌Hep-2细胞的影响。方法:收集并筛选了 10例喉癌患者的肿瘤组织及癌旁组织。培养了正常人支气管上皮细胞系(BEAS-2B)和喉癌细胞系(SNU899、TU212和Hep-2)。使用miR-632 mimics、miR-632 mimics negative control、miR-632 inhibitor、miR-632 inhibitor negative control分别转染了对数生长期的Hep-2细胞,并依次将转染后的细胞命名为 NC-mimics 组、miR-632 mimics 组、NC-inhibitor 组、miR-632 inhibitor组。使用qRT-PCR技术检测了组织及细胞中miR-632的表达。使用MTT法检测了细胞的增殖能力。使用平板克隆实验检测了细胞的克隆形成能力。使用Western blot检测了细胞中cyclin D1和c-myc蛋白的表达。使用细胞划痕实验检测了细胞的迁移能力。使用Transwell实验检测了细胞的侵袭能力。结果:相较于癌旁组织,喉癌肿瘤组织中miR-632的相对表达量显著更高(P0.01);与 BEAS-2B 细胞相比,喉癌细胞系 SNU899、TU212 和 Hep-2 中 miR-632的相对表达量均显著上调(P0.01),且Hep-2细胞系中miR-632的相对表达量明显最高。与NC-mimics组相比,miR-632 mimics组细胞的OD560值显著更高(P0.01)、克隆形成数量显著更高(P0.01)、cyclin D1和c-myc蛋白的相对表达量显著上调(P0.01)、迁移细胞百分比显著更高(P0.01)、细胞侵袭百分比显著更高(P0.01)。而相较于inhibitor-NC组,miR-632 inhibitor组细胞的OD560值显著更低(P0.01)、克隆形成数量显著更低(P0.01)、cyclinD1和c-myc蛋白的相对表达量显著下调(P0.01)、迁移细胞百分比显著更低(P0.01)、细胞侵袭百分比显著更低(P0.01)。结论:miR-632在喉癌组织及细胞中表达上调,其上调后促进了 Hep-2细胞的增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力。第二部分GSK3β在喉癌组织和细胞中的表达水平及其对喉癌细胞Hep-2生物学特性的影响目的:本部分旨在研究GSK3β在喉癌组织及细胞中的表达及其对喉癌Hep-2细胞的影响。方法:使用GSK3β siRNA及其阴性对照链转染了对数生长期的Hep-2细胞,并分别将转染后的细胞命名为si-NC组、si-GSKββ组。使用qRT-PCR检测了细胞中GSK3β mRNA的表达。使用Westernblot分析检测了细胞中GSK3β蛋白的表达。使用MTT法检测了细胞的增殖能力。使用平板克隆实验检测了细胞的克隆形成能力。使用细胞划痕实验检测了细胞的迁移能力。使用Transwell实验检测了细胞的侵袭能力。结果:相较于癌旁组织,GSK3βmRNA在喉癌肿瘤组织中的相对表达量显著下降(P0.01);且与BEAS-2B细胞相比,喉癌细胞系(SNU899、TU212和Hep-2)中GSK3β mRNA及蛋白的相对表达量显著下降(P0.01),且Hep-2细胞系中GSK3βmRNA及蛋白的相对表达量显著最低。与si-NC组相比,si-GSK3β组细胞的OD560值显著更高(P0.01)、细胞克隆形成数量显著更高(P0.01)、迁移细胞百分比显著更高(P0.01)、细胞侵袭百分比显著更高(P0.01)。结论:GSK3β在喉癌组织和细胞中下调,其下调后促进了 Hep-2细胞的增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力。第三部分miR-632通过靶向调控GSK3β表达影响喉癌细胞Hep-2的生物学特性目的:本部分旨在研究miR-632与GSK3β之间的靶向关系,及其影响Hep-2细胞殖、迁移及侵袭的作用机制。方法:通过Target Scan在线预测了 miR-632与GSK3β之间的靶向关系。使用荧光素酶报告基因实验验证了 miR-632与GSK3β之间的靶向性。分别使用miR-632 inhibitor negative control 及GSK3β siRNA 阴性对照链、miR-632 inhibitor及 GSK3βsiRNA 阴性对照链、miR-632 inhibitor 及 GSK3β siRNA 共转染了 Hep-2 细胞,并分组如下:NC-inhibitor + si-NC 组、miR-632 inhibitor + si-NC 组、miR-632 inhibitor+ si-GSK3β组。使用qRT-PCR检测了细胞中GSK3β mRNA的表达。通过Western blot技术分析了细胞中GSK3β蛋白的表达。使用MTT法检测了细胞的增殖能力。使用平板克隆实验检测了细胞的克隆形成能力。使用细胞划痕实验检测了细胞的迁移能力。使用Transwell实验检测了细胞的侵袭能力。结果:Target Scan在线预测结果表明GSK3β是miR-632的靶基因,两者的结合位点位于3'UTR区。荧光素酶报告基因实验证明GSK3β是miR-632的下游靶基因。相较于 NC-mimics 组,miR-632 mimics 组 Hep-2 细胞中 GSK3β mRNA 及蛋白的相对表达量显著下降(P0.01),而与NC-inhibitor组相比较,miR-632 inhibitor组Hep-2细胞中GSK3β mRNA及蛋白的相对表达量显著上升(P0.01)。Pearson相关性分析显示,miR-632的相对表达量与喉癌组织中GSK3βmRNA的相对表达量之间呈现负相关性。相较于NC-inhibitor+ si-NC组,miR-632 inhibitor+si-NC组Hep-2细胞的OD560值显著下降(P0.01)、克隆形成数量显著更低(P0.01)、迁移细胞百分比显著更低(P0.01)、侵袭细胞百分比显著下降(P0.01);而 miR-632 inhibitor + si-GSK3β组细胞的 OD560 值、克隆形成数量、迁移细胞百分比、侵袭细胞百分比均显著高于miR-632 inhibitor +si-NC组(P0.01),且与NC-inhibitor + si-NC组之间的差异并不明显。结论:miR-632通过靶向负向调控GSK3β表达影响Hep-2细胞的增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力。
【图文】：
图２－２转染后各组细胞中ｍｉＲ－６３２的相对表达逡逑－－－－
图２－ｌ邋ｍｉＲ－６３２在喉癌组织及喉癌细胞中表达上调逡逑－ｍ－
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.65
【参考文献】
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2589103
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