藏红花酸对增生性玻璃体视网膜病变的抑制作用及分子机制研究

发布时间：2020-03-18 21:17

【摘要】：增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)是继发于孔源性视网膜脱离、严重的眼外伤或其修复术后发生的一种常见的难治性致盲性眼病。PVR及其引起的视网膜脱离是视网膜脱离复位术后手术失败的主要原因,发病率达5-10%。其发病机制包括:暴露于玻璃体腔的视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial,RPE)及神经胶质细胞增殖、移行、间质转化,在视网膜内、外表面及玻璃体腔形成纤维细胞膜并向细胞外分泌胶原纤维,继而纤维细胞膜收缩牵拉引起视网膜皱褶和脱离。PVR患者纤维细胞膜中细胞主要包含RPE、Müller/神经胶质细胞和成纤维细胞。孔源性视网膜脱离发生以后,血-视网膜屏障破坏,RPE暴露于血清中细胞因子,从Bruch膜脱离,细胞间紧密连接破坏并丢失了上皮细胞形态。没有细胞间紧密连接的抑制和在多种细胞因子的双重作用下,RPE细胞发生增殖、迁移、间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)为成纤维细胞样或肌成纤维样细胞,表现为移行、侵袭能力增加,凋亡减少和表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(vimentin)并分泌细胞外基质。RPE细胞发生EMT在PVR纤维细胞膜的形成中起了非常重要的作用。目前,临床上治疗PVR的主要方法还是玻璃体切割术。但是PVR患者玻璃体切割术后即使视网膜复位,由于复发性视网膜脱离及PVR发病过程中对视网膜的损伤,使得术后视功能恢复有限。因此,修复视网膜脱离一个关键的目标就是预防PVR的发生发展。药物防治PVR一直都受到广泛的关注,但大多局限在基础研究阶段,进入到临床试验阶段的药物目前还不能够有效的防治PVR。这就需要我们继续寻找安全、高效的新药。藏红花酸(crocetin)又名番红花酸或西红花酸,来源于茜草科植物栀子果实,是藏红花柱头的主要有效成分之一,具有多不饱和共轭烯酸结构,属类胡萝卜素物质。它的化学式为C_(20)H_(24)O_4,分子量为328.4。除了具有抗肿瘤、抗凋亡、抗炎、抗纤维化的作用外,还能减轻缺血再灌注引起的视网膜损伤,具有多重生物学作用。我们推测藏红花酸抑制细胞增殖、迁移、纤维化的生物学作用能够同样作用于PRE细胞,并抑制PVR的发生发展,同时能够降低视网膜的损伤,保护视功能。因此,本研究首次将藏红花酸应用于PVR防治,拟以RPE细胞和兔眼PVR模型为研究对象,在细胞和体内两个层面上展开研究。在细胞层面观察藏红花酸对RPE细胞增殖、迁移的抑制作用,对TGF-β_2诱导发生EMT的RPE细胞的逆转作用,并验证其可能作用的分子机制。在体内首先通过视网膜功能学及组织学的检测验证藏红花酸玻璃体腔注射是否具有眼内毒副作用;而后借助高效液相色谱分析得到藏红花酸在玻璃体腔内药代动力学过程;最后通过玻璃体腔注药,观察藏红花酸对兔眼PVR发生发展的抑制以及对视网膜的保护作用。为临床应用藏红花酸防治PVR提供实验基础和理论依据。第一部分藏红花酸抑制体外培养的ARPE-19细胞增殖和迁移目的:观察藏红花酸对体外培养的ARPE-19细胞增殖和迁移能力的影响。方法:依据加入藏红花酸药物浓度不同,依次将ARPE-19细胞分为:对照组(0μM组)和实验组(50μM组、100μM组、200μM组)。通过CCK-8实验检测藏红花酸对ARPE-19细胞增殖活性的影响;流式细胞术分析藏红花酸对ARPE-19细胞周期的影响;western blot检测不同浓度藏红花酸对ARPE-19细胞增殖相关蛋白PCNA、p53、p21表达的影响;划痕实验和Transwell小室两种方法来验证藏红花酸对ARPE-19细胞迁移能力的影响。结果:藏红花酸即使在低浓度(50μM)短时间(24h)内对ARPE-19细胞增殖具有抑制作用(P0.05),而且这种抑制呈现浓度和时间依赖性;流式细胞术细胞周期分析表明藏红花酸将细胞阻滞在G1期,使其无法进入S期而抑制细胞增殖;western blot蛋白检测发现50μM藏红花酸即能诱导细胞p53、p21表达升高(P0.05),200μM藏红花酸能够显著升高p53及其下游蛋白p21的表达(P0.01)并抑制PCNA的表达(P0.01);划痕实验和Transwell小室结果一致,50μM药物组对细胞迁移能力无影响,100μM和200μM药物组细胞创伤愈合能力和穿膜细胞数量较对照组明显下降。结论:藏红花酸通过将ARPE-19细胞周期阻滞在G1期,上调p53及其下游p21的表达并抑制PCNA的表达来抑制细胞增殖,同时抑制ARPE-19细胞水平方向和垂直方向的迁移能力。第二部分藏红花酸通过p38抑制TGF-β_2介导的ARPE-19细胞EMT目的:观察藏红花酸在体外能否抑制TGF-β_2介导ARPE-19细胞发生EMT,并验证可能的通路。方法:依据是否加入TGF-β_2和加入藏红花酸药物浓度不同,依次将ARPE-19细胞分为:阴性对照组、阳性对照组(10ng/mL TGF-β_2)、实验组1(10ng/mL TGF-β_2+50μM藏红花酸)、实验组2(10ng/mL TGF-β_2+100μM藏红花酸)、实验组3(10ng/mL TGF-β_2+200μM藏红花酸)。RT-qPCR、western blot和细胞免疫荧光双染色验证EMT相关分子转录和翻译水平。应用p38 MAPK抑制剂SB203580观察藏红花酸是否通过p38MAPK来抑制TGF-β_2介导ARPE-19细胞发生EMT。结果:加入10ng/mL TGF-β_2刺激48小时后,ARPE-19细胞由鹅卵石样典型上皮细胞形态延展增大变为长梭形,100μΜ和200μM藏红花酸能够抵抗TGF-β_2引起细胞形态改变,维持细胞的上皮形态;RT-q PCR和western blot结果表明ARPE-19细胞高表达上皮细胞标记物ZO-1和E-cadherin,低表达间质细胞标记物α-SMA和Vimentin,加入TGF-β_2刺激后,ARPE-19细胞发生EMT,ZO-1和E-cadherin表达明显减少,α-SMA和Vimentin表达明显升高,50μΜ-200μΜ藏红花酸均能抑制TGF-β_2介导的上皮细胞和间质细胞标记物蛋白表达水平的改变,并呈现出浓度依赖性;对阴性对照组、阳性对照组及200μΜ藏红花酸组进行细胞免疫荧光双染,结果与前面一致;10μΜSB203580预处理ARPE-19细胞能够阻断TGF-β_2引起的p38的磷酸化,并抑制α-SMA的表达,藏红花酸同样能够抑制TGF-β_2引起的ARPE-19细胞p38的磷酸化,并呈现浓度依赖性,说明藏红花酸能够通过影响p38的活化来抑制TGF-β_2诱导的ARPE-19细胞发生EMT。结论:藏红花酸能够抑制p38 MAPK的活化来拮抗TGF-β_2诱导ARPE-19细胞发生EMT。第三部分藏红花酸兔眼玻璃体腔注射眼内毒副作用研究目的:通过观察视网膜结构和功能的变化来评估藏红花酸玻璃体腔注射的安全性。方法:选用8只色素兔,右眼为实验眼,注射0.2μmol藏红花酸(4只)或0.4μmol藏红花酸0.1ml(4只),左眼为对照眼,注射含对应DMSO浓度的0.1ml PBS。所有实验动物在注射前与注射后1、3、5、7、14天行裂隙灯和间接眼底镜检查。在注射前和注射后第7、14天进行特殊眼科检查:眼底照相、光学相干断层扫描(optical coherence tomography,OCT)和全视野视网膜电图(full-field clinical electroretinography,ffERG)。玻璃体腔注药后14天,眼科检查完毕,摘取眼球制作组织病理切片,行HE染色观察视网膜结构的完整性。结果:剔除一只发生玻璃腔积血的实验眼和一只因注射时损伤晶状体后囊致白内障的对照眼,其余对照眼裂隙灯及间接眼底镜检查无异常,实验眼在注射后第1天出现轻度玻璃体混浊,第3天恢复清亮,裂隙灯检查无异常;注射后14天,OCT及病理学检查显示实验眼和对照眼的视网膜各层结构完整清晰,无视网膜水肿、出血及萎缩;对比注射前、注射后第7、14天ffERG结果显示:在暗适应及明适应条件下,对照眼及实验眼的a波、b波振幅均无统计学差异(P0.05)。结论:0.4μmol藏红花酸及其以下剂量的玻璃体腔注射对色素兔眼部组织结构及功能无损害。第四部分藏红花酸在正常兔眼玻璃体内的药代动力学研究目的:应用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)测定0.4μmol藏红花酸色素兔玻璃腔注射后不同时间点的药物浓度及其药代动力学参数。方法:建立测定玻璃体中藏红花酸浓度的HPLC方法:设定色谱条件;建立玻璃体样品处理方法;建立标准曲线;对处理方法进行回收率、精密度测试。选用14只色素兔,双眼均注射0.4μmol藏红花酸眼内注射液,并于注射后即刻、1、3、7、12、24、48和72h分别处死实验动物2只,小心摘取4只眼球,获得完整的玻璃体,按上述建立的HPLC方法进行标本的处理和检测,得到每个时间点玻璃体腔藏红花酸药物浓度,建立药-时曲线,并进行药代动力学参数计算。结果:在选定色谱条件下,色素兔玻璃体上清液和玻璃体沉淀中内源性物质对藏红花酸及内标姜黄素的测定无干扰,藏红花酸和姜黄素分离完全,峰形良好,出峰时间分别在8.30min和4.79min。在选定色谱条件下,色素兔玻璃体上清液中藏红花酸浓度的标准曲线方程为y=0.0686x-0.0021,相关系数R2=0.9996,玻璃体沉淀中藏红花酸浓度的标准曲线方程为y=0.0069x-0.0015,相关系数R2=0.9996。低、中、高三个不同浓度的藏红花酸模拟玻璃体上清样品的提取回收率及日间、日内精密度符合实验要求。低、中、高三个不同浓度的藏红花酸模拟玻璃体沉淀样品的提取回收率及日间、日内精密度符合实验要求。依据标准曲线方程计算各时间点对应玻璃体上清藏红花酸药物浓度和玻璃体沉淀未溶解的藏红花酸质量,并建立药-时曲线,应用DAS 3.0软件采用非房室模型分析药代动力学参数显示,0.4μmol藏红花酸玻璃体腔注射后1h达到最大药物浓度36.77±3.39μg/mL(111.98±10.33μM),其半衰期为4.23±1.31h。结论:建立了测定色素兔玻璃体藏红花酸浓度的HPLC方法,该方法专属性强,稳定性好,回收率及精密度高;0.4μmol藏红花酸玻璃体腔注射后1h达到最大药物浓度36.77±3.39μg/mL(111.98±10.33μM),分布容积为3±0.11ml,清除率为0.1±0.02ml/h,半衰期为4.23±1.31h。第五部分藏红花酸防治兔增生性玻璃体视网膜病变的实验研究目的:观察藏红花酸玻璃体腔注射能否抑制色素兔PVR的发生发展。方法:选用20只色素兔,随机分为实验组和对照组,每组10只,对右眼进行操作。实验组右眼在PVR造模的同时注入预先配制的0.4μmol藏红花酸,对照组右眼在PVR造模的同时注入0.1ml PBS(含2%DMSO)。实验动物分别于造模前、造模后3、7、14、28行裂隙灯、间接眼底镜、眼底照相、OCT及ffERG检查。根据眼底检查情况,按Fastenberg分级法在造模后第7、14、28天进行PVR分级。并于造模后28天摘取模型眼行大体标本照相后进行组织病理学检查:HE染色观察视网膜组织的病理变化、Masson染色观察胶原纤维蛋白沉积情况、免疫组织化学观察α-SMA表达情况。结果:根据造模后第7、14、28天眼底检查情况,将各组实验动物依据Fastenberg分级并进行Mann-Whitney U检验:在造模后第7天实验组及对照组PVR分级无统计学差异;造模后第14天,实验组0级有3只,1级有6只,2级有1只,对照组1级有5只,2级有4只,3级有1只,对照组较实验组病情进展更快,差异有统计学意义(P=0.019);造模后第28天,实验组1级有3只,2级有5只,3级有2只,对照组2级有3只,3级有3只,4级有2只,5级有2只,实验组未出现广泛视网膜脱离及更严重的视网膜漏斗状脱离,差异有统计学意义(P=0.019)。OCT显示:造模后对照组玻璃体混浊更明显,于第7天玻璃体腔已经形成致密的增殖膜,第28天,视网膜出现广泛脱离并可见视网膜裂孔和皱褶;实验组造模后玻璃体混浊较轻,第28天可见网膜前增殖膜牵拉视网膜隆起,髓线抬高,放射状有髓神经纤维结构模糊。ffERG显示:在造模后第28天,对照组ERG波形几乎消失,实验组明暗适应条件下a波、b波振幅轻度下降。病理学检查显示:对照组玻璃体腔增殖膜及视网膜前膜更致密,胶原纤维及α-SMA表达呈强阳性,视网膜结构混乱;实验组视网膜结构相对整齐,视网膜前膜及玻璃体腔增殖膜单薄,胶原纤维及α-SMA表达呈弱阳性。结论:藏红花酸能够抑制色素兔PVR的进展,并减少玻璃体及视网膜前增殖膜的形成,保护视功能。
【图文】：

藏红花酸,细胞增殖

图 1 藏红花酸抑制 ARPE-19 细胞增殖Fig. 1 Crocetin inhibits ARPE-19 cell proliferation as determined by thCCK-8 assay.PE-19 cells were untreated or treated with different concentrations ofcetin (50, 100, and 200 μM) for 24, 48, and 72 h. Absorbance at 450 nmowed a significant decrease in the growth of crocetin-treated cells compth that in the control cells in a dose- and time- dependent manner. *P< 0P< 0.01, ***P< 0.001. The data are presented as the mean ±S.D. (n =roup).

藏红花酸,细胞周期

图 2 藏红花酸阻滞 ARPE-19 细胞周期Fig. 2 Crocetin induces cell cycle arrest by flow cytometric analysis.ARPE-19 cells were harvested after treatment with or without 50 and 100 μMcrocetin for 24 h. DNA was stained with PI for flow cytometric analysis. Thenumber of cells in G1 phase was significantly increased in the crocetin-treatedgroup compared with that in the untreated group.
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R774.1

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