HUC-MSCs对变应性鼻炎鼻上皮细胞糖皮质激素受体表达的影响

发布时间：2020-03-23 00:27

【摘要】：第一部分HUC-MSCs的分离、培养、鉴定目的:体外分离、培养及鉴定人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,HUCMSCs),为HUCMSCs治疗小鼠Neu性变应性鼻炎模型做前期准备。方法:1.HUC-MSCs的分离、培养:无菌条件下,将新鲜脐带组织用D-Hanks缓冲液反复冲洗,剔除动、静脉和外膜等组织,剪碎至约1mm~3大小组织块,用胰蛋白酶消化后收集细胞沉淀均匀接种于培养瓶中,加入完全培养基,置于细胞培养箱内依次予4h后翻转培养瓶,24h后添加培养基,3d半量换液一次。观察细胞生长情况,细胞贴壁生长铺满瓶底约80%时,按照2:1比例进行传代,保存P3-P4代细胞用于后续实验。2.HUC-MSCs的鉴定:检测P3代细胞表面间充质干细胞标记物(CD34,CD45,CD73,CD90,CD105,HLA-DR)表达情况。同时进行P3代细胞成骨、成脂及成软骨分化能力。成骨诱导:第20d后观察有无钙结节出现,用茜素红染色鉴定成骨分化潜能。成脂诱导:第15d后观察有无脂滴出现,用油红O鉴定成脂分化潜能;成软骨诱导:第25d后观察细胞团块致密情况,用阿新蓝染色鉴定成软骨分化能力。结果:1.倒置显微镜下形态:细胞生长均匀,形态呈纺锤形,连续传代10次以上形态无明显改变、细胞无衰老迹象。2.HUCMSCs细胞标记物检测结果:流式细胞仪检测结果显示CD34,CD45,CD73,CD90,CD105,HLA-DR表达率分别是0.12,0.17,99.93,99.83,99.77,0.09,符合HUC-MSCs细胞表面标志物特点。成骨、成脂、成软骨诱导分别能观察到铁锈红色钙结节、脂滴红染、深蓝色细胞团块。结论:HUC-MSCs能通过贴壁培养法分离、培养出纯度较高具有多向分化能力的细胞。第二部分Neu性变应性鼻炎小鼠模型的建立以及HUC-MSCs调控糖皮质激素受体a表达的效应观察目的:建立卵清蛋白(OVA)联合脂多糖(LPS)诱导的中性粒细胞(Neutrophils,Neu)性小鼠变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)模型,观察HUC-MSCs对AR模型(1)行为学指标,(2)细胞因子,(3)鼻粘膜组织上皮细胞(nasal epithelial cells,NECs)糖皮质激素受体a(Glucocorticoid receptor alpha,GRa)的影响,研究OVA联合LPS能建立中性粒细胞Neu性小鼠AR模型,抑制GRa核转录出现糖皮质激素抵抗(Glucocorticoid resistance,GR),证实HUC-MSCs通过提高GRa核转录功能对AR模型起到治疗作用。方法:1.Neu性AR小鼠模型的建立:将BALB/c雌性小鼠用无卵清蛋白脱敏喂养4周后在第1d,7d,14d予腹腔注射卵清蛋白(OVA)予基础致敏后,在22d-28d内每天一次行滴鼻OVA+LPS激发。每天滴鼻结束后观察30min流涕、挠鼻及喷嚏情况并记录。29d处死小鼠收集鼻腔灌洗液(nasal lavage fluid,NLF)及鼻组织标本,观察鼻粘膜组织病理改变、细胞分类计数、细胞因子(IL-4、IL-17、IFN-γ)水平变化。2.HUC-MSCs对AR模型的治疗:将AR造模小鼠分为AR+HUC-MSCs+Dex(MSCs治疗组),AR+Dex(地塞米松治疗组)和OVA+Dex(对照组)。在基础致敏结束后,MSCs治疗组和Dex治疗组分别予HUC-MSCs悬液(细胞数量1×10~6)尾静脉注射和Dex(1mg/ml)腹腔注射隔天一次,连续3次。观察各组小鼠的行为学变化,滴鼻激发致敏结束后处死小鼠收集NLF及鼻粘膜标本,观察鼻粘膜组织病理改变、细胞分类计数、细胞因子(IL-4、IL-17、IFN-γ)及NECs胞浆、胞核GRa表达情况及蛋白水平的检测。结果:予LPS联合OVA造模与OVA造模比较,均能出现明显流涕、挠鼻及喷嚏情况,鼻粘膜病理结果表明鼻粘膜嗜酸性粒细胞(Eosinophil,Eos)及Neu浸润明显,NLF细胞计数Eos及Neu明显增多,IL-4、IL-17水平上调,IFN-γ水平下降,血清Ig E水平升高,Dex干预下GRa不能从胞浆转运至胞核。HUC-MSCs治疗Nue性AR模型后行为评分明显改善,降低Eos、Neu、Ig E、IL-4、IL-17水平,胞核GRa水平升高。结论:LPS联合OVA连续滴鼻激发可以成功构建Neu性小鼠AR模型,且造成对GRa核转位障碍所致的Dex治疗的糖皮质激素(Glucocorticoid,GC)不敏感;HUC-MSCs可以通过改善GRa核转位障碍提高Dex的作用,起到治疗对激素不敏感的的Neu性AR的作用。第三部分HUC-MSCs调控人鼻粘膜上皮细胞糖皮质激素受体表达的影响及机制研究目的:研究体外LPS联合OVA诱导人鼻粘膜上皮细胞(Human nasal epithelial cells,HNECs)GRa和糖皮质激素受体β(Glucocorticoid receptor beta,GRβ)及IL-4和IL-17的变化,证实HUC-MSCs通过旁分泌作用降低IL-17水平改善GRa、GRβ比例失调纠正GRa、GRβ比例失调,从而改善激素抵抗。方法:1.将HNECs根据干预手段分组如下:OVA组;OVA组+LPS组;OVA组+LPS+Dex组;OVA组+Dex组;采用免疫荧光检测GRa、GRβ的表达部位,收集各组细胞GRa、GRβ的m RNA及蛋白检测,上清液IL-4、IL-17的检测。2.将HNECs根据添加细胞因子不同分组如下:IL-4;IL-17组。采用免疫荧光检测GRa、GRβ的表达部位,收集各组细胞GRa、GRβ的m RNA及蛋白检测。3.HUC-MSCs与HNECs采用Transwell共培养,根据添加干预因子不同分组如下:OVA组+LPS组;OVA组+LPS+Dex组;OVA+LPS+HUC-MSCs+Dex组;OVA组+LPS组+IL-17;OVA组+LPS+IL-17+Dex组;OVA+LPS+IL-17+HUC-MSCs采用免疫荧光检测GRa、GRβ的表达部位,收集各组细胞GRa、GRβ的m RNA及蛋白检测。结果:OVA联合LPS刺激HNECs后,GRa的的m RNA及蛋白水平下降,GRβ的m RNA及蛋白水平升高,分泌IL-4、IL-17增多,与HUC-MSCs共培养后,OVA+LPS干预下的HNECs的GRβ的m RNA及蛋白水平下降,IL-17干预下的HNECs的GRβ的m RNA及蛋白水平上升,HUC-MSCs干预后,GRβ的m RNA及蛋白水平下调。结论:HUC-MSCs对OVA+LPS诱导下的HNECs的GRa与GRβ比例失衡有纠正作用,能降低GRβ水平,IL-17是HNECs GRa与GRβ比例失衡的重要细胞因子;HUC-MSCs可能通过旁分泌某种细胞因子拮抗IL-17作用降低HNECs的GRβ表达,达到纠正GR表达异常的作用。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R765.21

【参考文献】