STGC3高表达对CNE2细胞放疗敏感性的影响

发布时间：2020-04-14 16:51

【摘要】：目的:恢复STGC3基因在鼻咽癌CNE2细胞高表达,分析CNE2细胞对X射线敏感性,探讨可能增敏分子机制。方法:1.构建RTP-STGC3-his慢病毒表达载体,感染CNE2细胞,建立CNE2-RTP-STGC3-his细胞系。2.实验分为两组,(1)照射组:CNE2-RTP-STGC3-his细胞(转STGC3基因)、CNE2-RTP-his细胞(转空载体)及CNE2组,以6MV X线照射2分钟,总剂量为4Gy。(2)未照射组:CNE2-RTP-STGC3-his细胞(转STGC3基因)、CNE2-RTP-his细胞(转空载体)及CNE2组,3.采用CCK-8方法,检测受照射细胞的活力。4.使用Transwell实验,检测受照射细胞迁移侵袭能力。5.应用SDS-PAGE电泳及蛋白质质谱分析,检测受照射细胞蛋白表达差异。6.施用Western Blot方法,验证受照射细胞部分差异表达蛋白质分子,以及LC3、p62、p-S6和p-ULK1自噬相关蛋白质分子的表达水平。结果:1.成功建立CNE2-RTP-STGC3-his及CNE2-RTP-his细胞系,STGC3基因在CNE2-RTP-STGC3-his高表达(课题前期完成)。红色荧光蛋白(RFP)检测,荧光显微镜下细胞内可见RFP表达,转基因及转空载体组细胞表达RFP数目均80%,Western Blot检测结果,显示STGC3蛋白CNE2-RTP-STGC3-his稳定高表达(p0.05),用于后续实验。2.CCK-8实验结果显示,经X线照射,CNE2-RTP-STGC3-his细胞活力,低于CNE2-RTP-his细胞,差异具有统计学意义(p0.05)。3.Transwell实验结果显示,经X线照射,CNE2-RTP-STGC3-his细胞迁移侵袭细胞数小于对照组,差异具有统计学意义(p0.05)。4.SDS-PAGE电泳、蛋白质鉴定、Mascot数据库分析,结果显示,照射组与未照射组比较,细胞呈现出14-3-3、TUBA1B及calnexin蛋白质分子的表达水平升高。5.Western Blot检测结果显示,照射CNE2-RTP-STGC3-his细胞,14-3-3和自噬相关蛋白LC3-II表达水平降低(p0.05),p62、p-S6及p-ULK1表达水平升高,差异具有统计学意义(p0.05)。结论:1.STGC3基因在CNE2细胞高表达,增强放疗敏感性,其机制可能与抑制自噬有关。
【图文】：

转染效率,荧光显微镜

期构建完成。本实验通过红色荧光蛋白（RFP）评估感染效率。将各组细胞置于荧光显微镜下，观察 RFP 的表达情况。结果显示，CNE2-RTP-his 细胞和CNE2-RTP-STGC3-his细胞内RFP表达，且荧光细胞数目＞80%（图3.1.1）。CNE2 CNE2-RTP-his CNE2-RTP-STGC3-his图3.1.1 荧光显微镜下观察转染效率（×200）b. 提取 CNE2 （空白对照组）， CNE2-RTP-his （转空载体组）及CNE2-RTP-STGC3-his（转STGC3基因组）细胞总蛋白，通过Western Blot检测各组细胞中STGC3蛋白的表达。结果显示，在CNE2-RTP-STGC3-his中，STGC3蛋白稳定高表达，用于后续实验（图3.1.2）。

蛋白表达,细胞,实验检测,细胞活力

图3.1.2 Western Blot检测各组细胞中STGC3蛋白表达1：CNE2 2：CNE2-RTP-his 3：CNE2-RTP-STGC3-his*p＜0.05，vs CNE2-RTP-his3.2 CCK-8 实验检测照射后各组细胞活力X 线照射后，，将 CNE2，CNE2-RTP-his，CNE2-RTP-STGC3-his 细胞分别于0h、4h、24h 加入 CCK-8 试剂，并测量各组 450nm 处的 OD 值。结果显示，CNE2-RTP-STGC3-his 细胞在照射后 4h,24h 的 OD 值低于 CNE2-RTP-his 细胞（表3.2.1），差异具有统计学意义（p<0.05），这表明 STGC3 基因高表达能降低 X线照射后鼻咽癌 CNE2 细胞的活力。表3.2.1 CCK-8法测定OD值（mean±SD, n=6）时间 CNE2 CNE2-RTP-his CNE2-RTP-STGC3-his
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.63

【参考文献】